Vad är RNA-seq?
RNA-seq (RNA-sekvensering) är en teknik som kan undersöka mängden och sekvenserna av RNA i ett prov med hjälp av nästa generations sekvensering (ngs). Den analyserar transkriptom av genuttryck mönster kodade inom vår RNA. Här tittar vi på varför RNA-seq är användbart, hur tekniken fungerar och det grundläggande protokollet som vanligtvis används idag1.
vilka tillämpningar av RNA-seq?,
RNA-seq låter oss undersöka och upptäcka transkriptomen, det totala cellulära innehållet i RNAs inklusive mRNA, rRNA och tRNA. Förstå transkriptom är nyckeln om vi ska ansluta informationen om vårt genom med dess funktionella proteinuttryck. RNA-seq kan berätta vilka gener som är påslagna i en cell, vad deras uttrycksnivå är och vid vilka tillfällen de aktiveras eller stängs AV2. Detta gör det möjligt för forskare att djupare förstå cellens biologi och bedöma förändringar som kan indikera sjukdom., Några av de mest populära tekniker som använder RNA-seq är transkriptionell profilering, SNP identifiering, RNA redigering och differentierad genuttryck analysis3.
detta kan ge forskare viktig information om funktionen av gener. Till exempel kan transkriptomet Markera alla vävnader där en gen med okänd funktion uttrycks, vilket kan indikera vad dess roll är. Det fångar också information om alternativa splitsningshändelser (Figur 1), som producerar olika transkript från en enda gensekvens. Dessa händelser skulle inte plockas upp av DNA-sekvensering., Det kan också identifiera post-transkriptionell förändringar som inträffar under mRNA bearbetning såsom polyadenylation och 5′ capping2.
Figur 1: RNA-seq data använder använder korta läsningar av mRNA som är gratis för intronic icke-kodande DNA. Dessa läsningar måste sedan anpassas tillbaka till referensgenomet.
hur verkar RNA-seq?
tidiga RNA-seq-tekniker använde Sanger-sekvenseringsteknik, en teknik som även om den var innovativ vid den tiden också var låg genomströmning, kostsam och felaktig., Det är först nyligen, med tillkomsten och spridningen av NGS-teknik, har vi kunnat dra full nytta av RNA-seqs potential4.
det första steget i tekniken innebär att man omvandlar rna-populationen till cDNA-fragment (ett cDNA-bibliotek). Detta gör att RNA kan sättas in i ett ngs-arbetsflöde. Adaptrar läggs sedan till varje ände av fragmenten. Dessa adaptrar innehåller funktionella element som tillåter sekvensering; till exempel förstärkningselementet och den primära sekvenseringsplatsen., CDNA-biblioteket analyseras sedan av NGS, som producerar korta sekvenser som motsvarar antingen en eller båda ändarna av fragmentet. Djupet som biblioteket sekvenseras varierar beroende på tekniker som utdata kommer att användas för. Sekvenseringen följer ofta antingen enkellästa eller parade sekvenseringsmetoder. Enkellästa sekvensering är en billigare och snabbare teknik (för referens, ca 1% av kostnaden för Sanger sekvensering) som sekvenserar cDNA från bara en ände, medan Parade-end metoder sekvens från båda ändarna, och är därför dyrare och tid-konsumering5,6.,
ytterligare ett val måste göras mellan strängspecifika och icke-strängspecifika protokoll. Den tidigare metoden innebär att informationen om vilken DNA-sträng som transkriberades behålls. Värdet av extra information som erhållits från strängspecifika protokoll gör dem till det gynnsamma alternativet.
dessa läser, av vilka det kommer att finnas många miljoner i slutet av arbetsflödet, kan sedan anpassas till ett Genom av referens och monteras för att producera en RNA-sekvenskarta som spänner över transcriptome7.,
RNA-seq vs microarrays: varför RNA-seq anses vara överlägsen
RNA-seq betraktas allmänt som överlägsen annan teknik, såsom mikroarrayhybridisering. Det finns flera orsaker till RNA-seq: s väl ansedda status
en RNA-seq protocolexperimentplanering
förberedelse innan du börjar ditt RNA-seq-experiment är viktigt. Frågor att svara innan du börjar inkludera10:
•vilken metod för RNA-rening använder du?
•hur många läsningar behöver du?
•vilken plattform kommer du att använda?,
•vilket referensgenom kommer du att använda?
•hur bedömer du kvaliteten på ditt RNA?
•behöver du berika ditt mål RNA?
•kommer du streckkod din RNA?
•har jag tillräckligt med biologiska och tekniska replikat?
•enkelläst eller parad-end sekvensering?
cDNA Library Preparation
Efter att dessa punkter har beaktats kan du börja förbereda ditt cDNA-bibliotek. Detta kommer att kräva att lägga till plattformsspecifika ”adaptersekvenser” och förstärkning av DNA, men den exakta proceduren kommer att vara mycket specifik för den plattform som används i detta skede., Förstärkningen av DNA involverar en omvänd transkriptas medierad första strängsyntes följt av en DNA-polymeras-medierad andra strängsyntesen10, 11.
cDNA-sekvensering
när biblioteket är förberett och Adaptrar läggs till kan du använda din valda sekvenseringsplattform för att sekvensera ditt cDNA-bibliotek till önskat djup. När dina utskriftsdata har producerats kan du kartlägga data till ditt referensgenom., Anpassningsprocessen kan kompliceras av närvaron av skarvvarianter och modifieringar, och valet av referensgenom som används kommer också att variera hur svårt detta stadium är. Programvarupaket som STAR är användbara i detta skede, liksom kvalitetskontrollverktyg som Picard eller Qualimap12.
RNA-Seq dataanalys
efter justeringsstadiet kan du fokusera på att analysera dina data. Verktyg som Sailfish, rsem och BitSeq12 hjälper dig att kvantifiera dina uttrycksnivåer, medan verktyg som MISO, som kvantifierar alternativt splitsade gener, är tillgängliga för mer specialiserad analys13., Det finns ett bibliotek av dessa verktyg där ute, och läsa recensioner och roundups är ditt bästa sätt att hitta rätt verktyg för din forskning.
för att sammanfatta är dagens RNA-seq väl etablerat som det överlägsna alternativet för mikroarrays och kommer sannolikt att förbli det föredragna alternativet för tillfället.
5.https://systemsbiology.columbia.edu/genome-sequencing-defining-your-experiment
6.https://emea.illumina.com/science/technology/next-generation-sequencing/paired-end-vs-single-read-sequencing.html
9.https://cofactorgenomics.com/advantages-rna-seq-over-microarray-technology/
10.http://bioinformatics.ucdavis.edu/docs/2015-june-workshop/_downloads/Th_MB_RNASeq_Intro.pdf
11.https://rnaseq.uoregon.edu/#library-prep-stranded-libraries