djur
alla experiment utfördes med användning av icke-uppfödare manliga och kvinnliga C57/B6 möss (2-3 månader gammal). Varje kön bidrog till ungefär hälften av det totala antalet djur i varje experiment. Djur hölls i en 12/12 h mörk / ljus cykel och hade obegränsad tillgång till mat och vatten., Användningen av möss i dessa experiment var i enlighet med Handboken för Skötsel och Användning av försöksdjur och experimentell protokoll godkändes av University of Southern California Institutionella Djurens Skötsel och Användning Kommittén (IACUC).
ljusexponering
ögon vidgades med 0, 5% tropikamid oftalmisk lösning, USP (AKORN) och 2, 5% fenylefrinhydroklorid oftalmisk lösning, USP (AKORN). Mössen var mörkanpassade över natten., De hölls i mörker eller utsattes för ett diffust kallt vitt fluorescerande ljus vid luminescens nivå av 5000 lux för 30 min till 1 h innan de euthanized. De mörkanpassade proverna för båda metoderna framställdes i ett mörkrum under infrarött ljus och alla procedurer som omfattade mörkanpassad vävnad utfördes med ett dissekeringsmikroskop utrustat med infraröda omvandlare (B. E. Meyers & Co, Inc.). De ljusexponerade proverna behandlades under ett dissekeringsområde i rumsljus.,
Näthinnedissektion
möss eutaniserades genom inhalation av isofluran följt av cervikal dislokation. Ögonen var enukleerade och retinas isolerades i en 35 × 10 mm petriskål fylld med lämplig buffert/lösning som beskrivs nedan. Hornhinnan, linsen och glaskroppen avlägsnades från varje öga och det retinala pigmenterade epitelet (RPE) och sclera avlägsnades noggrant från varje näthinna. De isolerade näthinnorna var hemisekterade med en fjäderskalpell i en 60 × 15 mm maträtt och kanterna trimmades för att skapa två rektanglar., Minimera krökningen av varje halverad näthinnan assisterad i tillplattning av näthinnan och säkerställde en noggrann skal av retinala skikt. Korrekt trimning av näthinnans vikningskanter är viktigt: om näthinnan har vikningskanter när den placeras på filterpapperet, kommer det att resultera i ett minskat utbyte av isolerade ROS och ännu viktigare kommer att förorenas med andra retinala skikt.
immunocytokemi
före enukleation markerades hornhinnans överlägsna pol med cauterization och hornhinnan, linsen och glaskroppen avlägsnades därefter., De återstående ögonkopparna placerades i 4% paraformaldehyd i PBS i 15 min och sköljdes 3 gånger i 10 min i PBS. Ögat koppar var cryoprotected i 30 viktprocent sackaros i PBS för 2 h, placeras i Vävnad-Teck® O. C. T. förening (Sakura Finetek, USA) och snabbt fryses i flytande N2. De frusna blocken sektionerades vid 10 µm i en kryostat (CM 3050 s, Leica Microsystems) och lagrades i -80 °C. Före antikroppsinkubation jämviktades sektionerna till rumstemperatur (RT) i 15 min., För GNAT1-färgning med TF-15-musens monoklonala antikropp utfördes epitope-hämtning: sektioner behandlades för 2 min RT med 0.02 mg / ml proteinas k i blockerande buffert (2% bovint serumalbumin, 2% getserum, 0.3% Triton X-100 i 1X PBS) och upphettades till 65 °C i 10 s följt av fem sköljningar med PBS. Blockerande buffert applicerades sedan på alla sektioner för 1 h. sektioner inkuberades antingen med kaninantikroppen mot ARR1 (c10c10 utspädd 1:100 i blockerande buffert) eller TF-15 (CytoSignal, utspädd 1:200 i blockerande buffert)., Sektionerna sköljdes och inkuberades med en fluoresceinmärkt sekundär antikropp (Vektorlaboratorier). Alla sektioner var sedan dubbelfärgade med den biotinylerade antikroppen mot rhodopsin (1D4 utspädd 1:300 i blockerande buffert). Sektionerna sköljdes och inkuberades med rhodamine Avidin D (1:100, Vektorlaboratorier). Bilder erhölls med ett Zeiss AxioPlan2-mikroskop. Ljusa och mörka förhållanden avbildades med identiska exponeringstider.,
ROS-samling genom sekventiell skalning med filterpapper
filterpappersskalningsmetoden anpassades från en teknik för att exponera fluorescently taggade bipolära celler i en retinal flat mount för patch clamp recordings . Skalar bort fotoreceptorcellens flera lager med filterpapper exponerar gradvis de bipolära celldendriterna och cellkropparna för enklare åtkomst för elektrisk stimulering och patch clamp-avläsningar. Vi fann att de skalade biprodukterna, fotoreceptorskikten som sitter fast på filterpapperet, var mottagliga för efterföljande västerländska blot-analyser.,
Ames medium användes för manipulation av levande retinalvävnad (Sigma-Aldrich a1420). Två olika buffertar bereddes: Ames’ – HEPES (till 1 l lägg 2,38 g HEPES, 0.877 g NaCl, pH 7.4) och Ames’-bikarbonat (till 1 l lägg 1,9 g NaHCO3, pH 7.4). Båda framställdes i förväg, steril filtrerades och lagrades vid 4 ° C. alla procedurer utfördes vid RT., Före retinal dissektion bubblades 50-100 mL Ames’-HEPES med 100% O2 i en GibcoTM 100 mL mediaflaska (Thermo Fisher, USA) och 50-100 mL Ames’-bikarbonat bubblades med 95% O2 och 5% CO2 i en lätttät behållare i 15-20 min före användning.
Retinas framställdes enligt beskrivningen i avsnittet ”näthinnan dissektion” och lagras i en lätt tät behållare med Ames’-bikarbonat bubblade med 95% O2 och 5% CO2 för att upprätthålla Fysiologiskt pH., Detta inkubationstillstånd är identiskt med det som används av retinala fysiologer för ex vivo elektroretinograminspelningar eller sugelektrodinspelningar , och kan upprätthålla vävnadsviabilitet och funktionalitet i flera timmar. En halverad Bit rektangulär trimmad näthinna användes för varje avskalningsprocedur. Vävnaden överfördes via en 1.7 mL plastöverföringspipett (spetsskärning) till en 35 × 10 mm petriskål innehållande oxygenerade Ames’-HEPES. Medierna uppdaterades var 10: e minut under avskalningsprocessen för att bibehålla det syresatta tillståndet., Näthinnan i lösningen var orienterad med fotoreceptorsidan vänd nedåt med pincett och överföringspipetten. En 5 mm × 2,5 mm rektangulär bit filterpapper skuren från VWR grade 413 filterpapper (diameter 5,5 cm, porstorlek 5 µm, VWR, USA) placerades i petriskålen bredvid näthinnan. Näthinnan flyttades försiktigt med pincett (lätt håller kanterna) på filterpapperet med fotoreceptorsidan nedåt. När näthinnan var centrerad på filterpapperet lyftes båda försiktigt ut ur Ames-HEPES., Undersidan av filterpapperet (sidan utan näthinnan) blottades på pappershandduk för att suga upp vätskan på filterpapperet (2-3 dabs). Detta skapade en säker vidhäftning mellan fotoreceptorcellerna och fibrerna i filterpapperet, och denna bilaga var viktig för att avlägsna ROS-skiktet. En droppe Ames ’ – HEPES från petriskålen placerades på näthinnan och filterpappret blottades igen på pappershandduken. Detta upprepades totalt tre gånger., Filterpapperet med näthinnan placerades sedan tillbaka i petriskålen och nedsänktes och vävnaden avlägsnades från filterpapperet med pincett. Försiktighet togs för att bara röra den extrema omkretsen av näthinnan för att bevara näthinnans strukturella integritet. För att underlätta avskalningsprocessen skalades kanterna på näthinnan försiktigt bort från filterpapperet från varje sida, vilket lossar vidhäftningen av näthinnan till filterpapperet., När näthinnan avlägsnades från filterpappret blottades filterpapprets bottenyta på en pappershandduk och placerades i ett rör märkt +ROS och hölls på is. Den avskalningsprocess som beskrivits ovan upprepades ungefär 7-8 gånger. Efter 5 peeling blev näthinnan tunnare, mer transparent och var benägen att riva. Efter peeling placerades +ROS-röret innehållande de uppsamlade filterpappren och den återstående skalade halverade näthinnan i ROS-röret, fryst på torris och förvaras vid -80 °C.,
Separation av fotoreceptor fack genom peeling lyofiliserade näthinnan
denna metod anpassades från den som beskrivs av M. E. Guido, et al. , som utformade en ScotchTM tape peeling metod som utnyttjade lyofiliserade chick retinas att selektivt separera näthinnan i olika lager (fotoreceptorceller, inre kärn skikt, och ganglion celler)., Eftersom retinas från olika djurmodeller har olika stång-och konfördelningar och kan separera asymmetriskt med tejp efter lyofilisering, anpassade vi denna metod och utforskade dess användbarhet för separation av stångfack av musretinor.
frystorkning av isolerade retinas
Retinas framställdes enligt beskrivningen i avsnittet ”Retinal dissektion”. Kallringers (130 mM NaCl, 3.6 mM KCl, 2.4 mM MgCl2, 1.2 mM CaCl2, 10 mM HEPES, 0.02 mM EDTA, pH 7.4) användes under dissektionen. Andra fysiologiska buffertar, såsom Ames-HEPES, kan också användas., Eftersom flera prover ofta hanterades samtidigt märktes de 5 × 2,5 mm filterpappersbitarna (Whatman® Grade 1 kvalitativt filterpapper (diameter 9 cm, porstorlek 11 µm, GE Healthcare, USA) i förväg innan de placerades i en petriskål fylld med kall Ringers buffert. För varje prov placerades en halverad rektangulär bit av näthinnan på filterpapperet med hjälp av en 1.7 mL överföringspipett (skuren spets) med ganglion-cellsidan nedåt och fotoreceptorns yttre segment uppåt., När vävnaden centrerades på filterpapperet lyftes båda ut ur ringarens buffert och botten av filterpapperet (sidan utan näthinnan på den) blottades på en pappershandduk (2-3 dabs) för att underlätta fastsättning av ganglion cellskiktet på filterpapperet. En droppe kall Ringers placerades på näthinnan, och filterpappersbotten blottades igen på pappershandduken. Detta upprepades totalt tre gånger. Ringers buffert byttes ut mot New cold Ringers buffert efter varje provberedning., Filterpapperet med fastsatt näthinna placerades i en petriskål fylld med kallringers tills alla prover bearbetades på samma sätt. Slutligen var var igen lyfts ut ur lösningen, botten av filterpappret blottades torr, och en droppe av kalla PBS placeras på filterpapper bredvid näthinnan, botten av filtret igen blottades, och placerades i en ren och torr 35 × 10 mm petriskål. Syftet med detta steg var att skölja av den mer komplexa Ringers med PBS för att minska mängden torkat salt på den lyofiliserade vävnaden., Efter att alla vävnadsprover hade bearbetats med detta slutliga sköljningssteg och samlats in i den rena petriskålen, var skålen lindad lätt tätt med två lager av 2,5 × 2,5 tums fyrkantiga bitar av aluminiumfolie, med små hål, så att de mörkanpassade näthinnproverna inte utsätts för ljus och snabbt fryses i flytande N2. De små hålen tillät flytande N2-åtkomst till inredningen, fyllde petriskålen och försiktighet togs för att säkerställa att hålen var förskjutna så att petriskålen var inslagna lätt tätt., Petriskål var då placerad i en 600 mL Labconco kolven med hjälp av en VirTis Bänk 2 K Lyophilizer (SP Vetenskapliga, USA) för 30 min till lyophilize vävnaden.
Peeling av retinal lager av ScotchTM tejp
frystorkat i näthinnans vävnader lagrades vid -80 °C i en DrieriteTM (W. A. Hammond Drierite Co, USA) fylld behållare eller var isolerade som +ROS, +RIS-och -ROS/RIS-utarmat vävnad (-OIS), fryst igen som ovan eller bearbetas för Western blotting samma dag. Alla peeling procedurer utfördes under rumsljus. Remsor mindre än 2.,5 mm i bredd skars och placerades på kanten av bandet dispenser tills trimmas i rektangulära bitar. En lyofiliserad näthinna fixerad till Whatman ® filterpapper placerades i en ren 10 cm petriskål. En liten rektangulär bit ScotchTM-tejp (något större än vävnadens yta) skars och försiktigt läggs ovanpå den lyofiliserade näthinnan. Att placera tejpen ovanpå den lyofiliserade näthinnan var nästan tillräcklig för att fästa det orangefärgade ROS-skiktet på tejpen., För att säkerställa fullständig kontakt med ROS med bandet applicerades litet tryck med pincett på toppen av tejpen för att säkerställa kontakt med den övre ytan. Efter noggrant skalning av tejpen vidhäftades det orangefärgade ROS-skiktet på tejpen och separerades från resten av näthinnan. Denna fraktion märktes +ROS och placerades i ett rent mikrofugerör. Ofta var en tunn, vit film synlig vid den brutna ytan av det orange skiktet på den första tejpskalan., Denna yta avlägsnades med mer tejpskal tills den var helt borttagen och den orange färgen på ROS-skiktet togs till ytan. Detta vita skikt ursprungligen fäst vid ROS placerades i ett separat rör och märkt + RIS fraktion. Tape användes för att ta bort kvarvarande retinalvävnad från filterpapperet och placerades i ett rör märkt-OIS., Mängden tryck som appliceras på tejpen för den ursprungliga skalen av det orangefärgade ROS-skiktet påverkade hur det lyofiliserade provet fraktionerat; för mycket tryck orsakade hela lyofiliserade näthinnan för att avlägsna filterpapperet på tejpen och för lite tryck separerade inte det övre apelsinskiktet från näthinnan. Ett par pass över bandet med minimalt tryck med pincett var till hjälp för att känna ut den minsta och maximala mängden tryck för att lägga till toppen av bandet.,
provberedning för Western blot: peeling med filterpapper
+ROS-rören som innehåller filterpapperna utsattes för en snabb spinning i en mikrocentrifug i 2 s och överskottsvätskan avlägsnades. Varje rör bearbetades var för sig (en halverad näthinna) eller två rör (två halverade retinor) kombinerades för mer koncentrerat material. +ROS-isolatet i ett enda rör homogeniserades i 45-60 µL kall RIPA-buffertbuffert (50 mM Tris-HCL pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1% natriumdeoxikolat, 0.1% SDS, 1 mM EDTA, 0.,1 M PMSF, komplett mini proteashämmare (Roche Applied Sciences)) och-ROS-isolatet i ett enda rör homogeniserades i 80-100 µL RIPA-buffert. När två rör kombinerades användes 80-110 µL kall RIPA-buffert för att homogenisera + ROS och 100-150 µL kallbuffert användes för-ROS. Alla rör homogeniserades i 1 min med en autoklaverad pestel. Stor försiktighet togs för att se till att filterpappersbitarna i +ROS-rören hölls på sidan av rören och stannade i kontakt med pestelen istället för att fastna i botten., Efter homogenisering användes sterila pincett för att flytta filterpappersbitarna till sidan av +ROS-röret, följt av 2-4 s spinning i mikrocentrifugen. Denna spin extraherade vätskan från papperet, och vätskan överfördes till ett rent rör och bearbetades för Western blot enligt beskrivningen nedan. Detta var det mest tidskrävande steget, och om det inte utfördes korrekt, kan mycket av provet sluta absorberas av bitar av filterpapper. För att maximera återvinningen av provet bör storleken på de filterpappersbitar som används för skalorna trimmas för att matcha området i retinalvävnaden.,
provberedning: peeling med ScotchTM-tejp
i likhet med filterskalningsmetoden kombinerades två rör, vardera innehållande ett skalat lager från en halv näthinna, för att öka proteinkoncentrationen. +ROS och +RIS prover var homogeniserade och som föreligger i 100-115 µL, och -OIS prover i 125 µL av kalla RIPA buffert. Alla rör homogeniserades i 1 min. Stor försiktighet togs för att se till att tejpen i +ROS, +RIS och-OIS-rören stannade i kontakt med pestelen och att tejpen hölls på sidan av rören istället för att fastna i botten., Efter homogenisering användes sterila pincett för att flytta bitar av tejp till sidan av rören. Rören spunnits i minicentrifugen i 2-4 s, varefter de torkade tejpbitarna försiktigt avlägsnades.
proteinkvantifiering, gelelektrofores och proteinimmunobloter
ett BCA-proteinanalyssats (Thermo Scientific, USA) användes för att bestämma den totala mängden protein i varje prov. Två mikroliter dnasei (10 enheter/µL, Roche, Schweiz) tillsattes till proverna och lämnades vid rumstemperatur i 30 min., Lämplig volym av 4x SDS-provbuffert (40% glycerol, 240 mM Tris-bas pH 6.8, 8% SDS, 5% ßME, 0.04% Bromofenolblå) tillsattes till homogenatet.,tr>
Approximately 10 μg of protein lysate was loaded per lane and separated on a pre-cast polyacrylamide Bis-Tris gel with a 4–12% gradient (Life Technologies, USA) and transferred onto nitrocellulose membrane., Membranen var blockerade i 10% mjölk/TBS-T buffert för 1 h i RT, och inkuberas över natten med följande antikroppar: kanin-anti-ARR1 antikropp (1:1000, ref), mus-anti-GNAT1 monoklonal antikropp (TF-15, 1:1000, CytoSignal), kanin-anti-β aktin antikropp (1:5000, GeneTex Inc.), kanin anti-RGS9 antikropp (1:1000), kanin anti-Gß5L/s (CT215) (1:2000), och kanin anti-cytokrom C polyklonal antikropp (1:500, Santa Cruz, sc-7159). Membran inkuberades med fluorescently märkta sekundära antikroppar (1: 10,000, LI-COR Biosciences) vid RT för 1 h., Proteinbanden detekterades av Odyssey ® infrared imaging system (LI-COR Biosciences, USA) och fluorescensintensiteten hos enskilda band kvantifierades med hjälp av ImageJ. GNAT1, ARR1 och RGS9 signaler var normaliserade mot Gß5L för +ROS, +RIS prover, och mot aktin för -ROS och -OIS prover. För varje oberoende experiment normaliserades fluorescerande signaler för varje protein i varje fack mot kombinerade signaler från alla retinala fack. Oparade 2-tailed t-test användes för att bestämma skillnader mellan två grupper.