differentiell migration av holo – och apo-metalloproteiner av MICS-BN-PAGE
medan ingen separation av holo- (Fe2-transferrin (Tf)) och apo-Tf observerades vid konventionell 1D Native (CBB G-250 Gratis)-sida (Fig. 1a) och SDS-PAGE (Fig., 1b), intressant nog fann vi att holo – och apo-Tf är helt åtskilda med hjälp av MIKROFONER-BN-SIDA (Fig. 1c) (det bör noteras att två band observerades för ett” rent ” apo-Tf-prov med BN-PAGE utan MICS-läge på grund av metalljonförorening; kompletterande Fig. S1). I SDS-sida beror detta förmodligen på dissociationen av metalljoner från holoformer som förekommer under starka denatureringsförhållanden14, 15 (data visas inte). Detta faktum tyder på att det elektroforetiska erkännandet mellan holo – och apo-former inte är tillgängligt för konventionella SIDMETODER., Dessa resultat innebär att specifika svaga denatureringsmedel, som CBB-g 250 anställda i MIC-BN-PAGE, känner igen skillnaden mellan holo – och apo-metalloproteiner för att förbättra separationen, förutom att undvika metalldissociation.
olika migrationsbeteenden för holo – och apo-former observerades också för ceruloplasmin (Cp) bunden med Cu2+ (cu-Cp) och superoxiddismutas (SOD) bunden med Cu2+ och Zn2+ (Cu/Zn-SOD) med metoden MICS-BN-PAGE (Fig. 1d-e). Apo-former migrerade till positioner i nära överensstämmelse med deras exakta molekylvikter i MICS-BN-PAGE (Fig., 1: TF, 77 kDa; Cp, 134 kDa; SOD, 32 kDa), vilket är användbart vid identifiering av proteinerna. Som beskrivs i Introduktionssektionen ledde dessa fynd till att vi utvecklade Holo / apo conversion(HAC)-2D MICS-BN-PAGE methodology för selektiv isolering av holo-metalloproteiner.
Concept of holo/apo conversion 2D MICS-BN-PAGE
vår nya 2D – sidsmetod baserad på differentialmigrationen mellan holo-och apo-metalloproteiner börjar med ett MICS-BN-SIDSTEG som utförs i två körfält (körfält A och B i Fig., 2, panel i) för att möjliggöra separation av holo-och apo-metalloproteiner från ett prov som innehåller båda metalloproteinformerna. De två körfälten utsätts sedan för två olika behandlingar efter den första MIC-BN-SIDESEPARATIONEN: Körfält a utsätts för ett andra MIC-BN-SIDESSTEG men endast efter att ha genomgått en Holo/apo-omvandlingsbehandling (Fig. 2 panel II-1); medan Körfält B levereras till ett METALLDETEKTERINGSSIDOR för att bestämma de metalljoner som är associerade med de separerade proteinerna (Fig. 2 panel II-2). Den behandling som tillämpas på Körfält B har tidigare validerats., Till exempel har bestämningen av vissa tungmetalljoner (Cu2+, Fe3+, Co3+, Ni2+, Mn2+ och Cd2+) i små volymprover (µL) vid ppt-och sub-ppb-nivåer med denna SIDMETOD utan användning av ett rent rum rapporterats21. Dessutom, denna tandem 1D MIKROFONER-BN-SIDA/metall upptäckt SIDAN metod visade den exakta fördelningen av Cu2+ i humant serum även för svagt albumin-bundna (utbytbara) Cu2+ 21, och föreslog att periplasmic Rubrivivax gelatinosus CopI protein högst delaktig i koppar motstånd är en koppar-bindande protein22., Fortfarande, för att helt identifiera metallbundna proteiner i ett komplext proteinprov är svårt på grund av sammigrerande proteiner. Till exempel har det inte visat sig att CopI är ett kopparbindande protein i R. gelatinosus, även om dess sekvens har tre putativa cu-bindningsställen: (i) ett kopparcentrum av typ 1 som finns i många koppardoxiner som azurin och plastocyanin, (ii) en Histidinrik N-terminus-sekvens och (iii) en histidin/Metioninrik sekvens. CopI-relaterade proteiner är närvarande i många bakterier men är inte allmänt bevarade; till exempel är det frånvarande från Escherichia coli22., Hittills har endast proteinerna av R. gelatinosus och Vibrio cholerae studerats och är involverade i Cu resistance22,23. I R. gelatinosus uttrycks CopI-protein starkt i närvaro av Cu2+; emellertid är cu-avgiftningsmekanismen fortfarande okänd. Således är en metod för isolering av metalloproteiner från alla andra proteiner som finns i komplexa biologiska prover nödvändiga.
begreppet hac-2D MICS-BN-PAGE / metal detection PAGE methodology., Panel i: 1D MICS-BN-sida i två körfält. Lane a utsattes för in-gel holo/apo omvandlingsproceduren (som i Panel II-1), och sedan Körfält a utsattes för 2D MICS-BN-sida efter holo/apo konvertering (som i Panel III). Lane B utsattes för Cu2+ och Fe3+ upptäckt SIDAN (som i Panel II-2). 2D-elektroferogrammet är för en blandning av metalloproteiner (holo-TF, apo-TF, holo-CP och holo-SOD), där holo-metalloproteiner i det ursprungliga provet isolerades som fläckar från den diagonala linjen (den prickade gula linjen i Panel III). Fullstorleksversioner av elektropherogram representerade i Fig., 2 avbildas i Fig. S2.
för att övervinna denna begränsning förstärks informationen från 1D MICS-BN-PAGE/metal detection PAGE analysis of Lane B genom att subjecting Lane A till en andra dimension av MICS-BN-PAGE efter Holo / apo conversion. För att genomföra denna analys blötläggs Lane A först i en sur metallkelatorlösning (se avsnittet metoder och Kompletterande för detaljerade villkor) för Holo/apo-omvandling (Fig. 2 panel II-1)., På så sätt derivatiseras holometalloproteinerna till metallfria apo-metalloproteiner i gelén av den första SIDDIMENSIONEN. Det behandlade körfältet a levereras sedan till det andra MICS-BN-SIDSTEGET med hjälp av en metallfri agarosgel (se Kompletterande Information). I det andra MIC-BN-sidsteget (Fig. 2, panel III), apo-metalloproteiner och icke-metalloproteiner från det ursprungliga provet migrerar på diagonallinjen, eftersom migrationen av dessa arter i den andra SIDDIMENSIONEN är helt identisk med deras migration i den första SIDDIMENSIONEN., Å andra sidan migrerar holo-metalloproteiner från det ursprungliga provet olika avstånd i de första och andra MICS-BN-SIDDIMENSIONERNA, eftersom dessa proteiner migrerar som deras holoformer i den första dimensionen och som deras apo-former i den andra dimensionen (och eftersom MICS-BN-PAGE resulterar i en annan elektroforetisk rörlighet för holo-och apo – former av metalloproteiner; vide infra). Således migrerar endast holometalloproteiner från det ursprungliga provet från den diagonala linjen i den andra dimensionen, som ska identifieras med MALDI-TOF MS utan ytterligare proteinrening., De typer och mängder av metalljoner som är bundna med metalloproteiner i den ursprungliga provlösningen (de isolerade som off-diagonal fläckar), kan bestämmas genom metalldetektering sida av körfält B, såsom beskrivits ovan. Därför är information om identifiering och distribution av metalloproteinarter, tillsammans med identiteter och koncentrationer av metalljoner de binder, tillgänglig från denna nya hac-2D MICS-BN-PAGE/metal detection PAGE methodology.,
selektiv isolering av metalloproteiner i Hac-2D MICS-BN-PAGE
För proof-of-concept demonstrerades HAC-2D MICS-BN-PAGE/metal detection PAGE för en provblandning innehållande holo-TF, apo-Tf, holo-CP och holo-SOD proteinstandarder (vilket resulterade i 2D-elektropherogrammet i Fig. 2, panel III), och även för ett humant serumprov (kompletterande Fig. S3). Fläckar av holometalloproteiner som migrerade från diagonallinjen observerades framgångsrikt för det blandade proteinprovet., Dessutom detekterades Fe3+ vid holo-Tf: s position och Cu2+ vid positionerna för holo-CP och holo-SOD, i det första MICS-BN-PAGE-steget med hjälp av METALLDETEKTERINGSSIDA. Om ingen Holo / apo-omvandling utförs migrerar alla proteiner på diagonallinjen (kompletterande Fig. S5). För ett humant serumprov upptäcktes holo-TF och holo-Cp framgångsrikt (kompletterande Fig. S3)., Således drogs slutsatsen att HAC-2D MICS-BN-PAGE/metal detection PAGE är mycket effektiv för isolering av holo-metalloproteiner och identifiering av metalljoner som ursprungligen var bundna till metalloproteiner i en proteinblandning.
slutligen applicerades HAC-2D MICS-BN-PAGE-metoden på en total bakterielöslig proteinfraktion erhållen från R. gelatinosusceller odlade i närvaro av 1,2 mM Cu2 + och uttryckte CopI-protein. Detta representerar ett biologiskt proteinprov., För detta prov hittades en plats utanför diagonallinjen vid positionen 100 kDa respektive 29 kDa på första respektive andra sidan (Fig. 3a). En hög koncentration av Cu2 + observerades vid positionen 97-139 kDa i den första MIC-BN-sidan (Fig. 3b). Följaktligen drogs slutsatsen att proteinet på denna plats har bundet till det. Platsen klipptes och analyserades därefter av MALDI-TOF MS. peptider motsvarande CopI identifierades (Fig. 3C, kompletterande Fig. S7 och Tabell S1)., Dessutom, när denna gelpunkt kördes på SDS-PAGE, observerades ett enda band av CopI-protein (data som inte visas). En annan plats utanför den diagonala linjen observerades vid cirka 40 kDa (ovanför 29 kDa CopI plats i den andra dimensionen (Fig. 3a)). Det bekräftades av MALDI-TOF MS att denna plats kommer också från CopI (och var förmodligen en dimer av CopI enligt molekylvikt). Således kan ett metalloprotein isoleras specifikt från en komplex proteinblandning samtidigt som den identifierar sin bundna metall., Denna analys av HAC-2D MICS-BN-PAGE visade definitivt att CopI är ett kopparbindande protein, och intressant, att denna egenskap kan relateras till proteinets cu-avgiftande funktion i bakteriell periplasma. Ytterligare kvantitativ analys avslöjade stökiometrin av Cu-Jon till CopI som 1: 1 (baserat på koncentrationerna av den bundna cu-Jonen (1.05 µM) och av holo-CopI-proteinet (0.95 µM) enligt bestämning av CBB r-250-färgning). Detta är i fullständig överenskommelse med andra experimentella resultat, som fann en Cu:CopI stökiometri 1:1.2 med hjälp av ICP-MS med ren CopI (Durand et al., opublicerade data). Detta resultat tyder på att vår metod också är användbar för undersökningar av metalloproteinstoichiometries.
HAC-2D MICS-BN-sida med silverfärgning (A), med Cu2+ DETEKTIONSSIDA (B), av en löslig fraktion erhållen från R. gelatinosusceller odlade i närvaro av 1,2 mM Cu2+ (totalt protein: 31,5 µg). Den terrängdiagonala fläck som indikeras av asterisken utsattes för MALDI-TOF MS (kompletterande Fig., S7), identifiera sekvenserna som visas i rött teckensnitt som en del av copi mogna sekvens (C). Fullstorleksversioner av elektropherogram representerade i Fig. 3 avbildas i kompletterande Fig. S8.
Kapillärelektroforesexperiment för att undersöka molekylära igenkänningslägen
upplösningsförbättringen mellan holo-och apo-former i MICS-sida assisterad med CBB-färgämne (Fig., 1c-e) är en viktig nyckel till vår metodik, och intressant verkar detta molekylära erkännande härröra från olika antal CBB g-250 färgämnesmolekyler som binder till var och en av de holo – vs. apo-formerna av metalloproteiner. Detta resulterar i sin tur sannolikt i olika effektiva laddningar och/eller inducerade steriska strukturer för färgproteinkomplexen. Båda dessa effekter skulle påverka elektroforetisk rörlighet., För att få djupare insikt om igenkänningsmekanismen för CBB g-250 färgämnesbindning mot holo – och apo-Tf utfördes CE-experiment tillsammans med dockningssimuleringar med hjälp av AutoDock Vina program24, 25 (vide infra). CZE utförs i fri vattenlösning utan en gelmatris, och därför behöver en molekylär sikteffekt inte beaktas i simuleringarna. Den elektroforetiska rörligheten hos holo-Tf mätt med CZE var uppenbarligen annorlunda än apo-Tf med tillsats av CBB-färgämnet (Fig. 4), medan dessa proteiner hade identiska rörligheter i frånvaro av färgämnet., Detta faktum tyder starkt på att antalet färgmolekyler bundna med holo – och apo-metalloproteiner är annorlunda. I CZE skulle migrationen av protein-färgämneskomplexet huvudsakligen påverkas av den effektiva laddningen av komplexet, vilket i sin tur skulle påverkas av antalet enstaka laddade anjoniska CBB-färgämnesmolekyler bundna till proteinet.,
typiska elektroferogram från cze – experiment för: 10 µM holo-eller apo-Tf utan CBB g-250 (övre gröna spår); och blandningar som innehåller 5 mM CBB g-250 färgämne med 10 µM Holo-TF (mellersta blå spår) eller med 10 µm apo-TF (nedre röda spår).,
traditionellt representeras den elektroforetiska rörligheten hos ett protein i fri lösning av Henry-ekvationen, som visas i ekvation (1):
här representerar q, η, r och k nettoladdningen, lösningens viskositet, proteinets radie och den inversa Debye-längden av elektrolytlösningen. Henry-funktionen, h, ökar monotont från 2/3 till 1., Strängt taget gäller denna formel uteslutande för en sfärisk molekyl med en centrosymmetrisk laddningsfördelning, även om det finns några diskussioner för att ändra Henry-ekvationen för att gälla för icke-sfäriska proteiner med komplex laddningsfördelning (inklusive dipol och quadrupole)26. I vårt fall deformeras Holo-och apo-Tf-molekyler sfärer av mycket liknande storlek (som liknar sfäroider med långa och korta axellängder på cirka 92 och 60 Å (holo-Tf) respektive 93 och 68 Å (apo-TF)) (kompletterande Fig. S9)., Dessutom förväntas dipol och quadrupol endast ha en mindre effekt på rörligheten eftersom CBB g-250-molekylerna bundna till holo – / apo-Tf inte är lokaliserade, vilket visas i kompletterande Fig. S9 (se nedan). Resultaten av exakta beräkningar av Kim et al.26 visar att den elektroforetiska rörligheten hos ett sfäriskt protein inte påverkas signifikant av en quadrupol i lösningar med låg jonstyrka (I < 0,01 m), och separationsbuffertens jonstyrka i våra cze-experiment var lika låg (i = 0,013 m).,
således är förhållandet mellan elektroforetiska rörligheter av apo – och holo-Tf-komplex med CBB g-250-färgämne (nämligen µApo/µHolo) hänförligt till förhållandet mellan nettoladdningarna för varje komplex (nämligen QApo/QHolo), som lätt kan härledas från Henry-ekvationen. De negativa nettoavgifterna för TF-CBB g-250-komplex härrör huvudsakligen från färgämnets bindningsnummer. Följaktligen ger värdet av µApo/µHolo också förhållandet mellan färgämnet (nämligen NApo / NHolo). Experimentellt, förhållandet mellan elektroforetiska rörligheter av de två formerna av Tf (µApo / µHolo = (-2.69 × 10-4)/(-2.,09 × 10-4)) befanns vara 1,29 av cze (Fig. 4), vilket motsvarar förhållandet mellan effektiv elektrisk laddning, förutsatt att storlekarna på båda formerna av Tf är likartade. Därför bör förhållandet mellan elektroforetiska mobiliteter överensstämma med förhållandet mellan färgmolekyler bundna. Ytterligare diskussion om förhållandet mellan elektroforetisk rörlighet och proteinform för andra metalloproteiner behövs emellertid i fall då holo – och apo-proteinformer skiljer sig åt (som för Cp).,
molekylär dockning simuleringsexperiment för att undersöka molekylär igenkänningslägen
färgämnesbindning bestämdes genom flexibla molekylär dockning simuleringar av AutoDock Vina27, utformad för att uttömmande söka efter bindningsställen och beräkna deras fria energier (Fig. 5 och Kompletterande Fig. S9). Nyligen Wang et al.25 rapporterade att AutoDock Vina har en hög poängkraft och mellanliggande provtagningskraft i förhållande till andra allmänt använda dockningsprogram., Enligt dessa simuleringar, större antal CBB g-250 färgämnesmolekyler bundna till lediga Fe-bindande platser i apo-Tf jämfört med holo-Tf (Fig. 5A) observerades. Baserat på dessa Autodock Vina-simuleringar befanns förhållandet mellan Färgämnesbindningsnumret NApo/NHolo vara 1,23, med en bindande energi <-6,5 kcal/mol (motsvarande K ~ 104,4 M-1) (Fig. 5B för färgämnesbindningsnumret kumulativ frekvensfördelning som en funktion av bindande energi), vilket är i god överenskommelse med våra CZE-resultat, som diskuterats tidigare (NApo/NHolo = 1.29)., Kvantitativ bindning antas med tillsats av färgämnet vid mM-nivåer (över 95% av bindningsställena interagerar med färgämnet när log K är 4, 4 eller större), som i dessa experiment.
bindningsantalet färgämnesmolekyler med holo-Tf undersöktes också av cze-experiment (data visas inte), som bedöms från minskningen av fritt färgämne topp för en 1 mM CBB g-250 färgprov med och utan tillsats av 10 µM holo-Tf., Eftersom bindningsnumret mättes till att vara >18, antogs bindningsnumret för NHolo vara >20 i mics-BN-SIDEXPERIMENTEN (med 3,0 mM färgämne tillsatt). Detta bindande antal färgämnesmolekyler (>20) från cze-experiment är i god överensstämmelse med antalet bundna färgämnesmolekyler (N = 21) från molekylära dockningssimuleringar som skulle ge upphov till den förväntade affiniteten hos -6,5 kcal/mol, och så är våra resultat självkonsekventa.,
det framgår av dessa molekylära dockningssimuleringar och CZE-experiment att CBB g – 250 dye känner igen de olika kemiska strukturerna hos holo-och apo-metalloproteiner för att ge olika µ-värden. Mer detaljerade observationer av de simulerade bindningslägena tyder också på att CBB g-250-molekylen interagerar med aminosyrarester tillgängliga på grund av den mer öppna (utfällda) apo-TF-strukturen jämfört med den mer slutna (vikta) holo-TF-strukturen, medan färgämnet inte visar någon bindning direkt med Fe-bindande aminosyrarester (Asp392, Tyr429, Tyr517 och hans 585)., Således är det underförstått att färgämnet känner igen små skillnader mellan de vikta och utfällda kemiska strukturerna för metalloproteiner, vilka induceras genom bindning eller dissociation av metalljoner. Sådana små skillnader kan inte identifieras med andra konventionella separationsmetoder.
aminosyrarester som kommer i kontakt med färgämnesmolekylen i varje färgämnesbindningsställe i simuleringen (t.ex. kompletterande Fig. S10) kategoriserades enligt deras dominerande natur: hydrofob, hydrofil eller elektrostatisk laddning (som sammanfattas i Tilläggstabell S2 och tabell S3)., Enligt resultaten visade populationerna av varje typ av aminosyra som interagerar med färgämnesmolekyler ingen skillnad mellan holo-och apo-proteinformer (26-27% för hydrofoba, 37-40% för hydrofila, 33-35% för laddade rester i varje form). Antalet vätebindningar i apo-Tf (totalt 33; 1,2 per bindningsplats) var dock betydligt större än i holo-Tf (totalt 19; 0,9 per bindningsplats). När man fokuserade på de åtta bindningsställen i apo-Tf som inte fanns i holo-Tf (kompletterande tabell S3) konstaterades antalet h-obligationer per anläggning vara 2,1., Dessa resultat tyder starkt på att förändringar i vätebindningsinteraktionerna främst är ansvariga för differentieringen mellan holo – och apo-Tf-former, medan ytterligare undersökningar skulle behövas för att förstå den fullständiga mekanismen.