Das 16S rRNA-Gen wird für phylogenetische Studien verwendet, da es zwischen verschiedenen Bakterienarten und Archaeen stark konserviert ist. Carl Woese (1977) war Pionier dieser Verwendung von 16S-rRNA. Es wird vorgeschlagen, dass die 16S-rRNA-gen kann verwendet werden als eine zuverlässige molekulare Uhr, weil der 16S rRNA-Sequenzen aus entfernter Verwandte Bakterien-Linien sind gezeigt zu haben ähnliche Funktionalitäten. Einige thermophile Archaeen (z. B. Order Thermoproteales) enthalten 16S-rRNA-Gen-Intronen, die sich in stark konservierten Regionen befinden und das Glühen von „universellen“ Primern beeinflussen können., Mitochondriale und chloroplastische rRNA werden ebenfalls amplifiziert.
Das häufigste Primerpaar wurde von Weisburg et al. (1991) und wird derzeit als 27F und 1492R bezeichnet; für einige Anwendungen können jedoch kürzere Amplikons erforderlich sein, beispielsweise für die 454-Sequenzierung mit Titanchemie, wobei das Primerpaar 27F-534R V1 bis V3 abdeckt.Oft wird 8F anstelle von 27F verwendet.Die beiden Primer sind fast identisch, aber 27F hat ein M anstelle eines C. AGAGTTTGATCMTGGCTCAG im Vergleich zu 8F.,
| Primer name | Sequenz (5′-3′) | Ref.,td> | |
|---|---|---|---|
| 805R | GAC TAC CAG GGT ATC TAA TC | ||
| 533F | GTG CCA GCM GCC GCG GTA A | ||
| 518R | GTA TTA CCG CGG CTG CTG G | ||
| 1492R | CGG TTA CCT TGT TAC GAC TT |
PCR and NGS applicationsEdit
In addition to highly conserved primer binding sites, 16S rRNA gene sequences contain hypervariable regions that can provide species-specific signature sequences useful for identification of bacteria.,Infolgedessen ist die 16S-rRNA-Gensequenzierung in der medizinischen Mikrobiologie als schnelle und kostengünstige Alternative zu phänotypischen Methoden der bakteriellen Identifizierung weit verbreitet. Obwohl es ursprünglich zur Identifizierung von Bakterien verwendet wurde, wurde später festgestellt, dass die 16S-Sequenzierung Bakterien in völlig neue Arten umklassifizieren kann, oder sogar genera.It wurde auch verwendet, um neue Arten zu beschreiben, die noch nie erfolgreich kultiviert wurden.,Mit der Sequenzierung der dritten Generation in vielen Labors ist die gleichzeitige Identifizierung von Tausenden von 16S-rRNA-Sequenzen innerhalb von Stunden möglich, was metagenomische Studien ermöglicht, beispielsweise zur Darmflora.
Hypervariable Regionenedit
Das bakterielle 16S–Gen enthält neun hypervariable Regionen (V1-V9) von etwa 30 bis 100 Basenpaaren, die an der Sekundärstruktur der kleinen ribosomalen Untereinheit beteiligt sind., Der Grad der Erhaltung variiert stark zwischen hypervariablen Regionen, wobei mehr konservierte Regionen mit höherer Taxonomie und weniger konservierte Regionen mit niedrigeren Ebenen korrelieren, wie Gattung und Art. Während die gesamte 16S-Sequenz einen Vergleich aller hypervariablen Regionen ermöglicht, kann sie bei etwa 1.500 Basenpaaren prohibitiv teuer für Studien sein, die verschiedene Bakteriengemeinschaften identifizieren oder charakterisieren möchten., Diese Studien nutzen üblicherweise die Illumina-Plattform,die Lesevorgänge mit Raten 50-fach und 12.000-fach weniger teuer als 454 Pyrosequenzierung bzw. Illumina Sequencing ist zwar billiger und ermöglicht eine tiefere Community-Abdeckung, produziert jedoch nur 75-250 Basenpaare lang (bis zu 300 Basenpaare mit Illumina MiSeq) und verfügt über kein etabliertes Protokoll zum zuverlässigen Zusammenbau des gesamten Gens in Community-Proben. Vollständige hypervariable Regionen können jedoch aus einem einzigen Illumina-Lauf zusammengebaut werden, was sie zu idealen Zielen für die Plattform macht.,
Während 16S-hypervariable Regionen zwischen Bakterien dramatisch variieren können, behält das 16S-Gen insgesamt eine größere Längenhomogenität bei als sein eukaryotisches Gegenstück (18S-ribosomale RNA), was die Ausrichtung erleichtern kann. Darüber hinaus enthält das 16S-Gen hochkonservierte Sequenzen zwischen hypervariablen Regionen, was das Design universeller Primer ermöglicht, die zuverlässig dieselben Abschnitte der 16S-Sequenz über verschiedene Taxa hinweg erzeugen können. Obwohl keine hypervariable Region alle Bakterien von Domäne zu Art genau klassifizieren kann, können einige bestimmte taxonomische Ebenen zuverlässig vorhersagen., Viele Gemeinschaftsstudien wählen aus diesem Grund halbkonservierte hypervariable Regionen wie das V4 aus, da es eine Auflösung auf der Phylum-Ebene so genau wie das vollständige 16S-Gen liefern kann. Während weniger konservierte Regionen Schwierigkeiten haben, neue Arten zu klassifizieren, wenn die Taxonomie höherer Ordnung unbekannt ist, werden sie häufig verwendet, um das Vorhandensein spezifischer Krankheitserreger nachzuweisen. In einer Studie von Chakravorty et al. im Jahr 2007 charakterisierten die Autoren die V1-V8-Regionen einer Vielzahl von Krankheitserregern, um zu bestimmen, welche hypervariablen Regionen für krankheitsspezifische und breite Assays am nützlichsten wären., Unter anderem stellten sie fest, dass die V3-Region die Gattung für alle getesteten Krankheitserreger am besten identifizieren konnte und dass V6 die genaueste Unterscheidung zwischen allen getesteten CDC-beobachteten Krankheitserregern, einschließlich Milzbrand, war.
Während 16S hypervariable Region Analyse ist ein leistungsfähiges Werkzeug für bakterielle taxonomische Studien, es kämpft zwischen eng verwandten Arten zu unterscheiden. In den Familien Enterobacteriaceae, Clostridiaceae und Peptostreptococcaceae können Arten bis zu 99% Sequenzähnlichkeit über das gesamte 16S-Gen teilen., Infolgedessen können sich die V4-Sequenzen nur um wenige Nukleotide unterscheiden, sodass Referenzdatenbanken diese Bakterien nicht zuverlässig auf niedrigeren taxonomischen Ebenen klassifizieren können. Durch die Begrenzung der 16S-Analyse auf ausgewählte hypervariable Regionen können diese Studien Unterschiede in eng verwandten Taxa nicht beobachten und in einzelne taxonomische Einheiten gruppieren, wodurch die Gesamtvielfalt der Stichprobe unterschätzt wird. Darüber hinaus können Bakteriengenome mehrere 16S-Gene beherbergen, wobei die V1 -, V2-und V6-Regionen die größte Vielfalt an Intraspezien aufweisen., Obwohl es nicht die genaueste Methode zur Klassifizierung von Bakterienarten ist, bleibt die Analyse der hypervariablen Regionen eines der nützlichsten Instrumente, die bakteriellen Gemeinschaftsstudien zur Verfügung stehen.