16S ribosomalt RNA

16S rRNA-genet anvendes til fylogenetiske undersøgelser, da det er stærkt bevaret mellem forskellige bakteriearter og arkæa. Carl .oese (1977) banebrydende denne brug af 16S rRNA. Det foreslås, at 16S rRNA gen kan bruges som en pålidelig molekylær ur, fordi 16S rRNA sekvenser fra fjernt beslægtede bakterielle afstamninger er vist at have lignende funktionaliteter. Nogle termofile archaea (f order orden Thermoproteales) indeholder 16S rRNA gen introner, der er placeret i stærkt bevarede regioner og kan påvirke udglødning af “universelle” primere., Mitokondrie-og chloroplastisk rRNA forstærkes også.

det mest almindelige primerpar blev udtænkt af .eisburg et al. (1991), og er for øjeblikket betegnes som 27F og 1492R; men for nogle programmer kortere amplikoner kan være nødvendig, for eksempel for 454 sekventering med titanium kemi primer par 27F-534R dækker V1 til V3.Ofte 8F bruges snarere end 27F. De to primere, der er næsten identiske, men 27F har en M-i stedet for en C. AGAGTTTGATCMTGGCTCAG sammenlignet med 8F.,

PCR and NGS applicationsEdit

In addition to highly conserved primer binding sites, 16S rRNA gene sequences contain hypervariable regions that can provide species-specific signature sequences useful for identification of bacteria.,Som et resultat er 16S rRNA – gensekvensering blevet udbredt i medicinsk mikrobiologi som et hurtigt og billigt alternativ til fænotypiske metoder til bakteriel identifikation. Selv om det blev oprindeligt brugt til at identificere bakterier, 16S sekventering blev senere fundet at være i stand til at omklassificere bakterier ind på helt nye arter, eller endda slægter.Det er også blevet brugt til at beskrive nye arter, der har aldrig været en succes kulturperler.,Med tredje generationens sekventering, der kommer til mange laboratorier, er samtidig identifikation af tusinder af 16S rRNA-sekvenser mulig inden for få timer, hvilket tillader metagenomiske undersøgelser, for eksempel af tarmflora.

Hypervariable regionsEdit

Den bakterielle 16S-genet indeholder ni hypervariable regioner (V1–V9), der spænder fra 30 til 100 basepar lang, der er involveret i den sekundære struktur af små ribosom-underenheden., Graden af bevarelse varierer meget mellem hypervariable regioner, med mere bevarede regioner, der korrelerer med taksonomi på højere niveau og mindre bevarede regioner til lavere niveauer, såsom Slægt og arter. Mens hele 16S-sekvensen giver mulighed for sammenligning af alle hypervariable regioner, kan det ved cirka 1.500 basepar være uoverkommeligt dyrt for undersøgelser, der søger at identificere eller karakterisere forskellige bakteriesamfund., Disse undersøgelser bruger ofte Illumina-platformen, der producerer læsninger med hastigheder 50 gange og 12.000 gange billigere end henholdsvis 454 pyrose .uencing og Sanger-sekventering. Mens billigere og giver mulighed for dybere fællesskab dækning, Illumina sekventering kun producerer læser 75-250 basepar lange (op til 300 basepar med Illumina MiSeq), og har ikke etableret protokol til pålideligt at samle fuld-genet i fællesskab prøver. Fuld hypervariable regioner kan samles fra en enkelt Illumina køre, men gør dem ideelle mål for platformen.,mens 16S hypervariable regioner kan variere dramatisk mellem bakterier, opretholder 16S-genet som helhed større længdehomogenitet end dets eukaryote modstykke (18S ribosomalt RNA), hvilket kan gøre justeringer lettere. Derudover, 16S-genet indeholder stærkt konserverede sekvenser mellem hypervariable regioner, så design af universelle primere, der pålideligt kan producere de samme sektioner af 16S sekvens på tværs af de forskellige taxa. Selvom ingen hypervariabel region nøjagtigt kan klassificere alle bakterier fra domæne til art, kan nogle pålideligt forudsige specifikke taksonomiske niveauer., Mange samfundsstudier vælger semi-konserverede hypervariable regioner som V4 af denne grund, da det kan give opløsning på phylumniveauet lige så præcist som det fulde 16S-gen. Mens mindre bevarede regioner kæmper for at klassificere nye arter, når ta .onomi med højere orden er ukendt, bruges de ofte til at påvise tilstedeværelsen af specifikke patogener. I en undersøgelse af Chakravorty et al. i 2007 karakteriserede forfatterne v1-V8-regionerne for en række patogener for at bestemme, hvilke hypervariable regioner der ville være mest nyttige at medtage til sygdomsspecifikke og brede assays., Blandt andre fund bemærkede de, at v3-regionen var bedst til at identificere slægten for alle testede patogener, og at V6 var den mest nøjagtige til at differentiere arter mellem alle testede CDC-overvågede patogener, inklusive miltbrand.mens 16S hypervariable regionanalyse er et kraftfuldt værktøj til bakterielle taksonomiske undersøgelser, kæmper det for at skelne mellem nært beslægtede arter. I familierne Enterobacteriaceae, Clostridiaceae og Peptostreptococcaceae kan arter dele op til 99% sekvenslighed på tværs af hele 16S genet., Som et resultat kan v4-sekvenserne kun afvige med nogle få nukleotider, hvilket efterlader referencedatabaser, der ikke er i stand til pålideligt at klassificere disse bakterier på lavere taksonomiske niveauer. Ved at begrænse 16S analyse for at vælge hypervariable regioner, disse undersøgelser, kan undlade at observere forskelle i nært beslægtede taxa og samle dem i en enkelt taksonomiske enheder, derfor undervurderer den samlede mangfoldighed af prøven. Desuden, bakterielle genomer kan rumme flere 16S gener, med V1, V2 og V6 regioner, der indeholder den største intraspecies mangfoldighed., Selvom det ikke er den mest præcise metode til klassificering af bakteriearter, er analyse af de hypervariable regioner stadig et af de mest nyttige værktøjer, der er tilgængelige for bakterielle samfundsundersøgelser.