Dyr
Alle eksperimenter, der blev udført ved hjælp af ikke-opdrætter mandlige og kvindelige C57/B6 mus (2-3 måneder). Hvert køn bidrog til omtrent halvdelen af det samlede dyretal i hvert forsøg. Dyrene blev opstaldet i en 12/12 h mørk / lys cyklus og havde ubegrænset adgang til mad og vand., Brug af mus i disse eksperimenter var i overensstemmelse med den Vejledning for Pleje og Brug af forsøgsdyr og eksperimentelle protokoller blev godkendt af University of Southern California Institutional Animal Care og Bruge Udvalg (IACUC).
Lys
Øjne blev udvidet med 0,5% Tropicamide Oftalmologiske Løsning, USP (AKORN) og 2,5% Phenylephrine Hydrochlorid Oftalmologiske Løsning, USP (AKORN). Musene var mørketilpassede natten over., De blev holdt i mørke eller udsat for et diffust køligt hvidt fluorescerende lys ved luminescensniveau på 5000 Lu.i 30 minutter til 1 time, før de blev aflivet. Mørke-tilpasset prøver for begge metoder blev udarbejdet i et mørkekammer i infrarødt lys og alle procedurer, der involverer mørke-tilpasset væv blev udført ved hjælp af en dissekering af mikroskop udstyret med infrarød omformere (B. E. Meyers & Co, Inc.). De lyseksponerede prøver blev behandlet under et dissekerende omfang i rumlys.,
Nethindedissektion
mus blev aflivet ved isofluraninhalation efterfulgt af cervikal dislokation. Øjnene blev enukleerede, og nethinderne blev isoleret i en petriskål på 35 10 10 mm fyldt med den passende buffer/opløsning beskrevet nedenfor. Hornhinden, linsen og glaslegemet humor blev fjernet fra hvert øje og nethinden pigmenterede epitel (RPE) og sclera blev omhyggeligt skrællet væk fra hver nethinden. De isolerede nethinder blev hemisected med en fjer skalpel i en 60 15 15 mm skål og kanterne blev trimmet til at skabe to rektangler., Minimering af krumningen af hver halveret nethinden assisteret i udfladning af nethinden og sikret en nøjagtig skræl af nethindelag. Korrekt trimning af nethindens sammenklappelige kanter er vigtig: hvis nethinden har sammenklappelige kanter, når den placeres på filterpapiret, vil det resultere i et reduceret udbytte af isoleret ROS og endnu vigtigere vil være forurenet med andre nethindelag.
Immunocytochemistry
Før enucleation, superior-pol af hornhinden var præget af cauterization og hornhinden, linse, og glasset blev efterfølgende fjernet., De resterende øjekopper blev anbragt i 4% paraformaldehyd i PBS i 15 minutter og skyllet 3 gange i 10 minutter i PBS. Øjet kopper var cryoprotected i 30% saccharose i PBS for 2 h, placeret i Væv-Teck® O. C. T. sammensatte (Sakura Finetek, USA) og hurtigt frosset i flydende N2. De frosne blokke blev skåret ved 10 µm i en kryostat (CM 3050 s, Leica Microsystems) og opbevaret i -80 C. C. Før antistofinkubation blev sektionerne ækvilibreret til stuetemperatur (RT) i 15 minutter., For GNAT1 farvning ved hjælp af TF-15 monoklonalt muse-antistof, epitopen hentning blev udført: afsnit blev behandlet i 2 min RT med 0,02 mg/ml proteinase K i blokerende buffer (2% bovin serum albumin, 2% ged serum, 0.3% Triton X-100 i 1X PBS) og er opvarmet til 65 °C til 10 s efterfulgt af fem skylninger med PBS. Blokerende buffer blev derefter anvendt til alle afsnit i 1 time. Sektioner enten blev inkuberet med kanin-antistof mod ARR1 (C10C10 fortyndet i forholdet 1:100 i blokerende buffer) eller TF-15 (CytoSignal, fortyndet 1:200 i blokerende buffer)., Sektionerne blev skyllet og inkuberet med et fluoresceinmærket sekundært antistof (Vektorlaboratorier). Alle sektioner blev derefter dobbeltfarvet med det biotinylerede antistof mod rhodopsin (1D4 fortyndet 1:300 i blokerende buffer). Sektionerne blev skyllet og inkuberet med rhodamin Avidin D (1:100, Vektorlaboratorier). Billeder blev opnået ved anvendelse af et microscopeeiss a .ioplan2 mikroskop. Lys og mørke forhold blev afbildet ved hjælp af identiske eksponeringstider.,
ROS-samling ved sekventiel skrælning med filterpapir
filterpapirskrælningsmetoden blev tilpasset fra en teknik til at udsætte fluorescerende mærkede bipolære celler i en nethindeflademontering til patchklemmeoptagelser . Afskalning af fotoreceptorcellens flere lag med filterpapir udsætter gradvist de bipolære celledendritter og cellelegemer for lettere adgang til elektrisk stimulering og patchklemmeaflæsninger. Vi fandt ud af, at de skrællede biprodukter, fotoreceptorlagene, der sidder fast på filterpapiret, var tilgængelige for efterfølgende Westernestern blot-analyser.,
Ames’ medium blev brugt til manipulation af levende nethindevæv (Sigma-Aldrich a1420). Der blev fremstillet to forskellige buffere: Ames’ – HEPES (til 1 L tilsættes 2,38 g HEPES, 0,877 g NaCl, pH 7,4) og Ames’-bicarbonat (til 1 L tilsættes 1,9 g NaHCO3, pH 7,4). Begge blev forberedt på forhånd, sterilt filtreret og opbevaret ved 4 C. C. alle procedurer blev udført ved RT., Før retinal dissektion, 50-100 mL af Ames’-HEPES var boblede med 100% O2 i en GibcoTM 100 mL medier flaske (Thermo Fisher, USA) og 50-100 mL af Ames’-bikarbonat var boblede med 95% O2 og 5% CO2 i en lystæt container i 15-20 min før brug.
Nethinder blev fremstillet som beskrevet i “Retina-dissektion’, og gemt i en lys stram beholder med Ames’-bikarbonat boblede med 95% O2 og 5% CO2 for at opretholde fysiologisk pH., Denne inkubationstilstand er identisk med den , der anvendes af nethindefysiologer til e.vivo-elektroretinogramoptagelser eller sugeelektrodeoptagelser, og kan opretholde vævslevedygtighed og funktionalitet i flere timer. Et halveret stykke rektangulært trimmet nethinden blev brugt til hver skrælningsprocedure. Det væv, der blev overført via en 1,7 mL plast overførsel pipette (tip cut) i en 35 × 10 mm petriskål indeholdende oxygenholdige Ames’-HEPES. Medierne blev opdateret hvert 10. minut under skrælningsprocessen for at opretholde den iltede tilstand., Nethinden i opløsning blev orienteret med fotoreceptorsiden vendt nedad ved hjælp af pincet og overføringspipetten. Et 5 mm 2.5 2,5 mm rektangulært stykke filterpapir skåret fra V .r klasse 413 filterpapir (diameter 5,5 cm, porestørrelse 5 µm, V .r, USA) blev anbragt i petriskålen ved siden af nethinden. Nethinden blev forsigtigt bevæget med pincet (let at holde kanterne) på filterpapiret med fotoreceptorsiden nedad. Når nethinden var centreret på filterpapiret, blev begge forsigtigt løftet ud af Ames ‘ – HEPES., Undersiden af filterpapiret (siden uden nethinden) blev blottet på papirhåndklæde for at opsuge væsken på filterpapiret (2-3 dabs). Dette skabte en sikker vedhæftning mellem fotoreceptorcellerne og fibrene i filterpapiret, og denne vedhæftning var vigtig for at fjerne ROS-laget. En dråbe Ames ‘ – HEPES fra petriskålen blev anbragt på nethinden, og filterpapiret blev slettet igen på papirhåndklædet. Dette blev gentaget i alt tre gange., Filterpapiret med nethinden blev derefter anbragt tilbage i petriskålen og nedsænket, og vævet blev fjernet fra filterpapiret med pincet. Der blev taget omhu for kun at berøre nethindens ekstreme omkreds for at bevare nethindens strukturelle integritet. For at lette skrælningsprocessen blev nethindens kanter forsigtigt skrællet væk fra filterpapiret fra hver side, hvilket løsnede nethindens vedhæftning til filterpapiret., Når nethinden blev fjernet fra filterpapiret, blev den nederste overflade af filterpapiret blottet på et papirhåndklæde og anbragt i et rør mærket +ROS og blev holdt på is. Den ovenfor beskrevne skrælningsproces blev gentaget cirka 7-8 gange. Efter 5 skræl blev nethinden tyndere, mere gennemsigtig og var tilbøjelig til at rive. Efter afskalning blev + ROS-røret indeholdende de opsamlede filterpapirer og den resterende skrællede halverede nethinden anbragt i-ROS-røret, frosset på tøris og opbevaret ved -80 C. C.,
Adskillelse af photoreceptor rum ved peeling frysetørrede retina
Denne metode blev tilpasset fra den, der er beskrevet af M. E. Guido, et al. , som har designet en ScotchTM tape peeling metode, der anvendes frysetørret kylling nethinder til selektivt at adskille nethinden i forskellige lag (photoreceptor celler, indre nukleare lag, og ganglion celler)., Da nethinder fra forskellige dyremodeller har forskellige stang og kegle-distributioner og kan adskille asymmetrisk med båndet efter lyofilisering, vi tilpasset denne metode og har udforsket sin værktøj til adskillelse af stang rum af musen nethinder.
frysetørring af isolerede nethinder
nethinder blev fremstillet som beskrevet i afsnittet ‘Retinal dissektion’. Kolde Ringer ‘ s (130 mM NaCl, 3,6 mM KCl, 2,4 mM MgCl2, 1.2 mM CaCl2, 10 mM HEPES, 0.02 mM EDTA, pH 7.4) blev anvendt under dissektion. Andre fysiologiske buffere, såsom Ames’-HEPES, kan også anvendes., Fordi flere af prøverne blev ofte håndteres på samme tid, den 5 × 2,5 mm filter papir stykker (Whatman® Grade 1 Kvalitative filtrerpapir (diameter 9 cm, porestørrelse 11 µm, GE Healthcare, USA)) blev mærket i god tid, før de blev placeret i en petriskål fyldt med koldt Ringer ‘ s buffer. For hver prøve blev et halveret, rektangulært stykke nethinden anbragt på filterpapiret ved hjælp af en 1, 7 mL overføringspipet (skåret spids) med ganglioncellesiden nedad og fotoreceptorens ydre segmentside opad., Når vævet var centreret på filterpapiret, blev begge løftet ud af Ringerens buffer, og bunden af filterpapiret (siden uden nethinden på den) blev blottet på et papirhåndklæde (2-3 dabs) for at lette fastgørelsen af ganglioncellelaget på filterpapiret. En dråbe kold Ringers blev anbragt på nethinden, og filterpapirbunden blev igen blottet på papirhåndklædet. Dette blev gentaget i alt tre gange. Ringers buffer blev byttet ud til ny kold Ringers buffer efter hver prøveforberedelse., Filtrerpapiret med fastgjort nethinden blev anbragt i en petriskål fyldt med kold Ringers, indtil alle prøver blev behandlet på samme måde. Endelig blev hver igen løftet ud af opløsningen, bunden af filterpapiret udslettet tørt og en dråbe kold PBS anbragt på filterpapiret ved siden af nethinden, bunden af filteret blev igen slettet og anbragt i en ren og tør 35 10 10 mm petriskål. Formålet med dette trin var at skylle de mere komplekse Ringers med PBS for at reducere mængden af tørret salt på det lyofiliserede væv., Efter alle vævs-prøver, der havde været behandlet med det sidste skyl skridt, og der er indsamlet i en ren petriskål, fadet var pakket lys stram med to lag af 2,5 × 2,5 tommer firkantede stykker folie af aluminium, med små huller, så at mørk-tilpasset retina-prøver er ikke udsættes for lys, og hurtigt frosset i flydende N2. De små huller tillod flydende N2 adgang ind i interiøret, påfyldning af petriskålen, og der blev sørget for, at hullerne blev forskudt, så petriskålen blev indpakket lystæt., Petriskålen blev derefter anbragt i en 600 mL Labconco-kolbe under anvendelse af en VirTis Benchtop 2 K Lyofilisator (SP Scientific, USA) i 30 minutter for at lyofilisere vævet.
Peeling af retinale lag af ScotchTM tape
frysetørret retinal væv, der blev opbevaret ved -80 °C i en DrieriteTM (W. A. Hammond Drierite Co, USA) er fyldt container eller var isolerede som +ROS, +RIS-og -ROS/RIS-forarmet væv (-OIS), frosset igen som ovenfor, eller som behandles til Western blotting samme dag. Alle skrælningsprocedurer blev udført under rumlys. Strimler mindre end 2.,5 mm i bredden blev skåret og anbragt på kanten af bånddispenseren, indtil den blev trimmet i rektangulære stykker. En lyofiliseret nethinde fastgjort til filterhatman filter filterpapir blev anbragt i en ren 10 cm petriskål. Et lille rektangulært stykke ScotchTM tape (lidt større end overfladen af vævet) blev skåret og omhyggeligt lagt oven på det lyofiliserede nethinden. Placering af båndet oven på det lyofiliserede nethinden var næsten tilstrækkeligt til at fastgøre det orange-tonede ROS-lag på båndet., For at sikre fuldstændig kontakt af ROS med båndet blev der påført let tryk med pincet på toppen af båndet for at sikre kontakt med den øverste overflade. Efter forsigtigt afskalning af båndet blev det orange-tonede ROS-lag klæbet til båndet og adskilt fra resten af nethinden. Denne fraktion blev mærket + ROS og anbragt i et rent mikrofugerør. Ofte var en tynd, hvid film synlig på den brudte overflade af det orange lag på den første båndskal., Denne overflade blev fjernet af flere båndskræller, indtil den blev helt fjernet, og ROS-lagets orange farve blev bragt til overfladen. Dette hvide lag, der oprindeligt var fastgjort til ROS, blev anbragt i et separat rør og mærket +RIS fraktion. Tape blev brugt til at fjerne det resterende nethindevæv fra filterpapiret og blev anbragt i et rør mærket-OIS., Mængden af pres der anvendes til tape for den oprindelige skaller af det orange-farvet ROS lag indflydelse på, hvordan frysetørret prøve fractioned; for meget pres forårsaget af hele frysetørrede nethinden til at skrælle filter papir på båndet, og for lidt pres ikke adskille den øverste orange lag fra nethinden. Et par passerer over båndet ved hjælp af minimalt tryk med pincet var nyttige i at føle den minimale og maksimale mængde tryk for at føje til toppen af båndet.,
prøveforberedelse til Westernestern blot: skrælning med filterpapir
+ROS-rørene indeholdende filterpapirerne blev underkastet en hurtig centrifugering i en mikrocentrifuge i 2 s, og overskydende væske blev fjernet. Hvert rør blev behandlet enkeltvis (en halveret nethinden) eller to rør (to halverede nethinder) blev kombineret til mere koncentreret materiale. Den +ROS isolere i et enkelt rør blev homogeniseret i 45-60 µL kolde RIPA buffer buffer (50 mM Tris–HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1% natrium deoxycholate, 0.1% SDS, 1 mM EDTA, 0.,1 M PMSF, komplet mini protease inhibitor (Roche Applied Sciences)), og -ROS isolere i et enkelt rør blev homogeniseret i 80-100 µL RIPA buffer. Når to rør blev kombineret, blev 80-110 µL kold RIPA buffer brugt til at homogenisere + ROS og 100-150 µL kold buffer blev brugt til-ROS. Alle rør blev homogeniseret i 1 min med en autoklaveret pistle. Der blev taget stor omhu for at sikre, at filterpapirstykkerne i + ROS-rørene blev holdt på siden af rørene og forblev i kontakt med pistlen i stedet for at sidde fast i bunden., Efter homogenisering blev sterile pincet brugt til at flytte filterpapirstykkerne til siden af +ROS-røret efterfulgt af 2-4 s spin i mikrocentrifugen. Dette spin ekstraherede væsken fra papiret, og væsken blev overført til et rent rør og behandlet til Westernestern blot som beskrevet nedenfor. Dette var det mest tidskrævende trin, og hvis det ikke udføres korrekt, kan meget af prøven ende med at blive absorberet af stykkerne filterpapir. For at maksimere genvinding af prøven, størrelsen af filterpapirstykker anvendes til skræl skal trimmes til at matche det område af nethindevæv.,
Prøvepræparation: skrælning med ScotchTM-tape
i lighed med filterskrælningsmetoden blev to rør, der hver indeholdt et skrællet lag fra halvdelen af nethinden, kombineret for at øge proteinkoncentrationen. +ROS og + RIS prøverne blev homogeniseret i 100-115 µL, og-OIS prøverne blev homogeniseret i 125 µL kold RIPA buffer. Alle rør blev homogeniseret i 1 min. Stor omhu, for at sikre, at båndet i +R, +RIS, og -OIS rør opholdt sig i kontakt med pistil, og at båndet blev holdt på siden af rørene i stedet for at hænge fast i bunden., Efter homogenisering blev sterile pincet brugt til at flytte båndstykker til siden af rørene. Rørene blev spundet i minicentrifugen i 2-4 s, hvorefter de tørrede stykker tape blev forsigtigt fjernet.
proteinkvantificering, gelelektroforese og proteinimmunoblotter
et BCA-proteinassaysæt (Thermo Scientific, USA) blev anvendt til at bestemme den totale mængde protein i hver prøve. To mikroliter DNaseI (10 enheder/µL, Roche, Sch .ei.) blev tilsat til prøverne og blev efterladt ved stuetemperatur i 30 minutter., Passende volumen af 4X SDS-prøvebuffer (40% glycerol, 240 mM Tris Base pH 6,8, 8% SDS, 5% ßME, 0,04% Bromphenolblå) blev tilsat til homogenatet.,tr>
Approximately 10 μg of protein lysate was loaded per lane and separated on a pre-cast polyacrylamide Bis-Tris gel with a 4–12% gradient (Life Technologies, USA) and transferred onto nitrocellulose membrane., De membraner, der blev blokeret i 10% mælk/TBS-T buffer for 1 timer ved RT og inkuberes natten over med følgende antistoffer: kanin anti-ARR1 antistof (1:1000, ref), mus anti-GNAT1 monoklonalt antistof (TF-15, 1:1000, CytoSignal), kanin anti-β-actin-antistof (1:5000, GeneTex Inc.), kanin anti-RGS9 antistof (1:1000), kanin anti-Gß5L/S (CT215) (1:2000), og rabbit anti-cytochrom C polyklonale antistof (1:500, Santa Cruz, sc-7159). Membraner blev inkuberet med fluorescerende mærkede sekundære antistoffer (1:10.000, LI-COR Biosciences) ved RT i 1 time., Proteinbåndene blev påvist af Odyssey infrared infrarød imaging system (LI-COR Biosciences, USA), og fluorescensintensiteten af individuelle bånd blev kvantificeret ved hjælp af ImageJ. GNAT1, ARR1, og RGS9 signaler blev normaliseret mod Gß5L for +ROS, +RIS prøver, og mod actin for -ROS og -OIS-prøver. For hvert uafhængigt eksperiment blev fluorescerende signaler for hvert protein i hvert rum også normaliseret mod kombinerede signaler fra alle retinale rum. Uparrede 2-tailed t-test blev brugt til at bestemme forskelle mellem to grupper.