udviklingen, differentieringen og væksten af celler og væv kræver nøjagtigt regulerede mønstre af genekspression. Forstærkere fungerer som cis-regulatoriske elementer for at formidle både rumlig og tidsmæssig kontrol af udvikling ved at tænde transkription i specifikke celler og/eller undertrykke den i andre celler. Således styrer den særlige kombination af transkriptionsfaktorer og andre DNA-bindende proteiner i et udviklende væv, hvilke gener der vil blive udtrykt i det væv. Forstærkere tillader det samme gen at blive brugt i forskellige processer i rum og tid.,
identifikation og karakteriseringrediger
traditionelt blev enhancere identificeret ved enhancer-fældeteknikker ved hjælp af et reportergen eller ved sammenlignende sekvensanalyse og beregningsgenomik. I genetisk tractable modeller som bananfluen Drosophila melanogaster, for eksempel, en journalist konstruere såsom lacZ-genet kan være tilfældigt integreret i genom ved hjælp af et P-element transposon. Hvis reportergenet integreres i nærheden af en forstærker, afspejler dets udtryk det ekspressionsmønster, der er drevet af den forstærker., Farvning af fluerne til Lac. – udtryk eller aktivitet og kloning af sekvensen omkring integrationsstedet tillader således identifikation af forstærkersekvensen.
udviklingen af genomiske og epigenomiske teknologier har imidlertid dramatisk ændret udsigterne for CIS-regulatory modules (CRM) opdagelse., Næste generation sequencing (NGS) metoder gør det nu muligt at high-throughput funktionel CRM opdagelse analyser, og de stærkt stigende mængder af tilgængelige data, herunder store biblioteker af transcription faktor binding site (TFBS) motiver, samlinger af kommenteret, valideret Crm, og omfattende epigenetiske data på tværs af mange celletyper, er at gøre præcis beregningsmæssige CRM discovery-et opnåeligt mål. Et eksempel på NGS-baseret tilgang kaldet DNase-se.har aktiveret identifikation af nukleosomudarmede eller åbne kromatinregioner, som kan indeholde CRM., For nylig er der udviklet teknikker som ATAC-se., som kræver mindre udgangsmateriale. Nucelosom udtømte regioner kan identificeres in vivo gennem ekspression af Dæmningsmethylase, hvilket giver mulighed for større kontrol med identifikation af celletype specifik forstærker.Beregningsmetoder inkluderer sammenlignende genomik, gruppering af kendte eller forudsagte TF-bindingssteder og overvågede maskinlæringsmetoder, der er trænet på kendte CRM ‘ er., Alle disse metoder har vist sig effektiv for CRM opdagelse, men hver har sine egne overvejelser og begrænsninger, og hver er underlagt et større eller mindre antal falsk-positive svar.I komparativ genomforskning tilgang, sekvens bevarelse af ikke-kodende regioner kan være et tegn på, smagsforstærkere. Sekvenser fra flere arter er justeret, og bevarede regioner identificeres beregningsmæssigt., Identificerede sekvenser kan derefter fastgøres til et reportergen, såsom grønt fluorescerende protein eller Lac.for at bestemme in vivo-mønsteret af genekspression produceret af forstærkeren, når det injiceres i et embryo. mRNA-ekspression af reporteren kan visualiseres ved in situ-hybridisering, hvilket giver et mere direkte mål for forstærkeraktivitet, da det ikke udsættes for kompleksiteten af oversættelse og proteinfoldning., Selv om mange beviser har peget på sekvens bevarelse for kritiske udviklingsmæssige forstærkere, andet arbejde har vist, at funktionen af forstærkere kan bevares med ringe eller ingen primær sekvens bevarelse. For eksempel har RET enhancers hos mennesker meget lidt sekvensbeskyttelse til dem i .ebrafisk, men begge arters sekvenser producerer næsten identiske mønstre af reportergenekspression i .ebrafisk., Ligeledes, i stærkt afveg insekter (separeret af omkring 350 millioner år), svarende genekspression mønstre af flere vigtige gener, der blev anset for at være reguleret gennem tilsvarende udgjorde Crm selv om disse Crm ‘ er viser ikke nogen nævneværdige sekvens bevarelse påvises ved standard sekvens alignment metoder som BLAST.
ved segmentering af insektrediger
forstærkerne, der bestemmer tidlig segmentering i Drosophila melanogaster-embryoner, er blandt de bedst karakteriserede udviklingsforstærkere., I det tidlige flueembryo er gap-gentranskriptionsfaktorerne ansvarlige for at aktivere og undertrykke et antal segmenteringsgener, såsom parregelgenerne. Gap-generne udtrykkes i blokke langs den forreste-bageste akse af fluen sammen med andre moderlige effekttranskriptionsfaktorer, hvilket skaber zonesoner, inden for hvilke forskellige kombinationer af transkriptionsfaktorer udtrykkes. Parregelgenerne adskilles fra hinanden af ikke-udtrykkende celler. I øvrigt, udtryksstriberne for forskellige parregelgener opvejes af et par cellediametre fra hinanden., Således skaber unikke kombinationer af parregelgenekspression rumlige domæner langs den anterior-posterior akse for at opsætte hvert af de 14 individuelle segmenter. Den 480 bp-forstærker, der er ansvarlig for at køre den skarpe stribe to af parregelgenet, der endda springes over (eve), er blevet godt karakteriseret. Forstærkeren indeholder 12 forskellige bindingssteder for moder-og gap-gentranskriptionsfaktorer. Aktivering og undertrykkelse af steder overlapper hinanden i rækkefølge., Eva udtrykkes kun i en smal stribe celler, der indeholder høje koncentrationer af aktivatorerne og lav koncentration af undertrykkerne for denne forstærkersekvens. Andre enhancer regioner drive eve udtryk i 6 andre striber i embryoet.
i hvirveldyrsmønsterrediger
etablering af kropsakser er et kritisk trin i dyreudviklingen. Under musens embryonale udvikling er Nodal, en transformerende vækstfaktor-beta superfamilie ligand, et Nøglegen involveret i mønstring af både den forreste-bageste akse og den venstre-højre akse i det tidlige embryo., Nodal-genet indeholder to forstærkere: den Proksimale Epiblasten Forstærker (PEE), og den Asymmetriske Forstærker (ASE). PEE er opstrøms for Nodalgenet og driver Nodalekspression i den del af den primitive stribe, der vil differentiere til noden (også kaldet den primitive knude). PEE tænder Nodal ekspression som reaktion på en kombination af signnt signalering plus et andet ukendt signal; således binder et medlem af LEF/TCF transkriptionsfaktorfamilien sandsynligvis til et TCF-bindingssted i cellerne i noden., Diffusion af Nodal væk fra knuden danner en gradient, som derefter mønstre den forløbende anterior-posterior akse af embryoet. ASE er en intronisk forstærker bundet af gaffelhoveddomænet transkriptionsfaktor fo .1. Tidligt i udviklingen etablerer fo .1-drevet Knudeudtryk den viscerale endoderm. Senere i udvikling, fo .1 binding til ASE driver Nodal udtryk på venstre side af den laterale plade mesoderm, således etablering venstre-højre asymmetri nødvendig for asymmetrisk organ udvikling i mesoderm.,
etablering af tre kimlag under gastrulation er et andet kritisk trin i dyreudviklingen. Hvert af de tre kimlag har unikke mønstre af genekspression, der fremmer deres differentiering og udvikling. Endoderm er specificeret tidligt i udviklingen af Gata4 udtryk, og Gata4 går videre til direkte tarm morfogenese senere. Gata4-udtryk styres i det tidlige embryo af en intronisk forstærker, der binder en anden forkhead-domænetranskriptionsfaktor, fo .a2., Oprindeligt forstærker driver bred genekspression i hele embryoet, men udtrykket bliver hurtigt begrænset til endoderm, tyder på, at andre repressors kan være involveret i dens begrænsning. Sent i udvikling begrænser den samme forstærker ekspression til vævene, der bliver maven og bugspytkirtlen. En ekstra forstærker er ansvarlig for at opretholde Gata4-udtryk i endoderm i de mellemliggende stadier af tarmudvikling.,
flere forstærkere fremmer udviklingsmæssig robusthedredit
nogle gener involveret i kritiske udviklingsprocesser indeholder flere forstærkere af overlappende funktion. Sekundære forstærkere, eller” Shado.enhancers”, kan findes mange kilobaser væk fra den primære forstærker (“primær” henviser normalt til den første forstærker opdaget, som ofte er tættere på genet det regulerer). På egen hånd driver hver forstærker næsten identiske mønstre af genekspression. Er de to forstærkere virkelig overflødige?, Nylige arbejde har vist, at flere forstærkere tillader bananfluer at overleve miljømæssige forstyrrelser, såsom en stigning i temperaturen. Når den hæves ved en forhøjet temperatur, undlader en enkelt forstærker undertiden at drive det komplette udtryksmønster, hvorimod tilstedeværelsen af begge forstærkere tillader normal genekspression.