Føtalt bovint serum (FBS) er den flydende fraktion af størknet blod fra fetal kalve, forarmet af celler, fibrin og koagulationsfaktorer, men indeholder et stort antal af ernærings-og makromolekylære faktorer afgørende for cellevækst. Bovint serumalbumin er den vigtigste komponent i FBS. Vækstfaktorer i FBS er afgørende for vedligeholdelse og vækst af dyrkede celler . FBS indeholder også en række små molekyler som aminosyrer, sukkerarter, lipider og hormoner.
FBS bruges i en lang række applikationer., En af de primære anvendelser af FBS er i eukaryot cellekultur, med koncentrationer op til 20% eller endnu højere, hvor det giver mange vigtige næringsstoffer og vækstfaktorer, der letter celleoverlevelse og proliferation. Imidlertid, det er vigtigt at bemærke, at FBS i humane cellekulturer kan introducere forskningsartefakter; humane celler dyrket med menneskelig sera opfører sig anderledes end dem, der dyrkes med FBS ., FBS bruges også til forskning, fremstilling og kontrol af humane og veterinære vacciner og biotek-lægemidler og bruges til at stoppe trypsinfordøjelsen eller til at tjene som beskyttelsesmiddel i kryopræservering . Cellekulturmedier uden serum har været i brug i mange år. Fetal bovine serum er måske ikke det bedste supplement til cellekultur. For eksempel forbedrer bovint serumalbumin med insulin-transferrin-natriumselenit og / eller epidermal vækstfaktor i dyrkningsmedium bovint embryokvalitet og trofoblastinvasion sammenlignet med føtal bovint serum .
føtal serum indeholder flere vækstfaktorer og har lavere gammaglobulin (dvs.antistoffer) indhold og ikke-føtal serum. Disse er vigtige, fordi vækstfaktorerne Letter celleoverlevelse og proliferation, mens antistoffer kan binde til cellerne i kultur. Derudover indeholder føtal serum lavere niveauer af komplementproteiner (komplementer) end dem fra voksne eller nyfødte. Disse komplementer har de uønskede virkninger af at lysere celler i kultur og forstyrre immunoassays.
Serum og plasma er begge afledt af fuldblod ved hjælp af centrifugering til fjernelse af komponenter, herunder røde blodlegemer. Forskellen mellem plasma og serum er, at koagulationsproteiner er til stede i plasma, men er blevet fjernet fra serum. Plasma fremstilles generelt ved at tilsætte antikoagulantia til blodet før centrifugering, men koagulationsproteinerne fjernes ikke. Serum fremstilles ved at lade blodet koagulere før centrifugering eller ved omfattende/progressiv centrifugering. Fibrinogen og proteiner forbundet med koagulering er således ikke til stede i serum.,
I mennesker, den følgende 22 proteiner, der udgør 99% af den samlede protein-indhold i serum og plasma -: albumin, total IgG, transferrin, fibrinogen, total IgA, alpha-2-macroglobulin, total og IgM -, alfa-1-antitrypsin, C3 supplement, haptoglobulin, alfa-1-acid glycoprotein, apolipoprotein B, apolipoprotein-A1, lipoprotein (a), faktor, H, ceruloplasmin, C4 supplere, komplementere faktor B, pre-albumin, C9 supplere, C1q supplement, og C8 supplement . De resterende 1% indeholder hundredvis af proteiner., Det mest rigelige serumprotein, albumin, ved 50 mg / ml, omfatter ca .halvdelen af den samlede proteinmasse.
International Serum Industry Association (ISIA; www.serumindustry.org), en handelsorganisation af serumudbydere, etablerede retningslinjer for kvalitetskontrol standardisering. Disse retningslinjer kræver, at følgende test udføres ved hjælp af specifikke metoder, og testresultaterne skal være tilgængelige som analysecertifikat (tabel 1).,h>Test
bakterier og svampe – sterilitet-test
mycoplasma
cytopatisk agenter – viral test
hemadsorbing agenter – viral test
bovin virus diarré – viral test
pH-måling
osmolalitet
total protein, bestemmes af Biuret-metode
endotoxin
hæmoglobin
elektroforese mønster
performance test, såsom stamceller kultur
radial immundiffusion
immunoglobulin
gamma-glutamyl transferase (GGT)
Tabel 1., Minimumskrav til serumtest.
Endotoxins, også kaldet lipopolysaccharide (LPS) eller lipooligosaccharide (LOS), kommer fra det ydre membraner af Gram-negative bakterier, og bidrager til, at de kliniske manifestationer af en bred vifte af patogene Gram-negative bakterier. In vivo inducerer endotoksiner feber og den inflammatoriske respons, mens de i cellekultur introducerer variation i cellulære reaktioner.
endotoksin niveauer måles ved limulus amebocyte lysate (LAL) test., Amebocytter er analoge med hvide blodlegemer hos hvirveldyr, og LAL fremstilles ud fra blodet af Limulus polyphemus (Amerikansk hestesko krabbe; Figur 1). LAL er meget følsom over for endotoksiner og koagulerer i nærvær af endda et minuts mængde endotoksin. Bevaringsstatus for den amerikanske hestesko krabbe er blevet vurderet og diskuteret i populærkulturen . Mange af hestesko krabber populationer er i fare, og derfor bør man sørge for at beskytte dem mod tab.
vi diskuterer nogle af almindeligt anvendte specialsera nedenfor. Serumpræparater dedikeret til specifikke forskningsemner, såsom lipoproteinmangel serum fra Kalen Biomedical til kolesterolforskning eller til specialiserede genekspressionssystemer , såsom tetracyclin-screenet føtal bovint serum, diskuteres ikke.
regelmæssig FBS indeholder et stort antal ekstracellulære vesikler, hvoraf nogle er eksosomer ., Når du udfører e .osomforskning med dyrkede celler, er det vigtigt at bruge FBS uden e .osomer. Det er dog vigtigt at være opmærksom på, at eksosomudarmet FBS kan påvirke og understøtte cellevækst anderledes end almindelig FBS . E .osom-udtømt FBS kan enten købes direkte fra flere kommercielle leverandører, eller udarbejdet gennem enten ultracentrifugering eller ultrafiltrering, selvom virkningerne af udtømning processer og/eller de kommercielle kilder ikke kan være konsekvent med hensyn til cellevækst og fysiologi .,
andre komponenter i FBS kan udtømmes afhængigt af de eksperimentelle krav. For eksempel, Galmo ..i A et al udtømt hæm fra FBS med ascorbinsyre.
en almindelig behandling af FBS er varmeinaktivering, hvor FBS opvarmes ved 56.C i 30 minutter i et vandbad med lejlighedsvis omrystning. Formålet er at inaktivere de komponenter i komplementsystemet , der er til stede i FBS, og andre potentielle ukendte hæmmere af cellevækst., Tidligere var varmeinaktivering også beregnet til at fjerne mycoplasma-forurening, hvilket ikke længere er et problem, da alle serumprodukter nu filtreres gennem porestørrelser, der er små nok til at fjerne mycoplasma. Det skal bemærkes, at varmeinaktivering også kan have uønskede virkninger, såsom at reducere kultiverede cellers evne til at binde sig til overflader . flere leverandører har opfordret brugerne til ikke at varmeinaktivere FBS til de fleste cellekulturbehov., I hvert tilfælde er det tilrådeligt at evaluere behovet for varmeinaktivering i en bestemt applikation, da forskellige celler har forskellige reaktioner på varmeinaktivering af FBS .
som alle andre protokoller med hensyn til FBS skal varmeinaktiveringsprocessen udføres med omhu, da en temperatur for høj eller langvarig opvarmning vil inaktivere vækstfaktorer og generere bundfald.
HY Tygge et al vedligeholdes A431, HCC1569, MCF7, MDA-MB-231, MDA-MB-468, SCC25, SKBR3, T47D, RENCA og CT26.WT-cellelinjer i medier med 10% (v/v) varmeinaktiveret FBS ., Freeman SA et al brugt varme-inaktiveret FBS hele i deres undersøgelse af makrofager . Aika .a t et al dyrkede mus primære gliaceller på poly-D-lysinbelagte kolber i DMEM indeholdende 10% varmeinaktiveret FBS fra MilliporeSigma (f2442) . Feldman D et al kulturperler HEK293FT celler i DMEM suppleret med varme-inaktiverede føtalt bovint serum fra Seradigm (97068-085), og A549, HCT116, HT1080, A375 celler med varme-inaktiverede føtalt bovint serum fra Sigma (F4135) til at vurdere optisk samlet skærme ., Kulkarni s et al vedligeholdt Hut-78 celler med varmeinaktiveret føtal bovint serum fra Atlanta Biologicals .
aktivt kul, som kan binde sig til lipofile molekyler, og dermed har været brugt til at fjerne hormoner som androgen, østradiol, progesteron, cortisol, testosteron, triiodothyronine (T3) og thyroxin (T4) fra FBS. Disse serumlipidhormoner har en tendens til at forstyrre immunoassaysystemer og insulinassaymetoder. Målt tumorcellevækst i kulturmedier suppleret med 10% trækul-strippet serum .,
dialyse kan fjerne alle molekyler med molekylvægt mindre end 10.000 m. fra FBS. Dette omfatter både polære og ikke-polære molekyler. Hormoner, cytokiner, glucose, aminosyrer og mange andre fjernes. Dialyse fjerner også antibiotika og andre eksogene molekyler i FBS.
Dialyzed FBS fra Thermo Fisher Scientific var der anvendes i kulturen i bugspytkirtlen duktalt adenocarcinoma for SILAC mass spec undersøgelse og andre SILAC undersøgelser , og i den kultur af HeLa celler med Opfyldt analog l-AHA puls-chase for klik-kemi påvisning af langlivet proteiner .,
Gamma-bestråling kan være en del af processen til sterilisering af FBS. FBS filtreres normalt gennem 0,1 um filtre flere gange for at eliminere mikroorganismer. Gammastråling kan inaktivere de vira, der almindeligvis forekommer hos kvæg. Imidlertid er nogle virale arter, såsom parvovirus, resistente over for gamma-bestråling.
selvom FBS har et ret lavt IgG-indhold, kan selv dette niveau være for højt til nogle bestemte applikationer. IgG – niveauet kan reduceres væsentligt yderligere ved indfangningskromatografi., FBS med lav IgG anvendes til antistofproduktion, rekombinant proteinsyntese og andre anvendelser.
Stamcellekultur har strenge krav med hensyn til vækstfaktorer. Nogle af de vækstfaktorer, der findes i FBS, fremmer stamcelledifferentiering. Flere virksomheder tilbyder embryonale stamceller kvalificeret FBS beregnet til at opretholde udifferentieret stamcelle. Det er dog vigtigt at teste specifikke masser af FBS for deres anvendelighed for at opretholde pluripotency/totipotency af forskellige typer stamceller., Thermo Fisher giver embryonale stamceller-kvalificeret FBS, som, for eksempel, anvendes i E14TG2a mus ES cellekultur af Yasuda S et al .
større kvæglande er de vigtigste udbydere af FBS. Landene omfatter USA, Australien, ne..ealand, Canada, flere i syd-og Mellemamerika.
produktionen og indsamlingen af serumprodukter reguleres af offentlige myndigheder. FBS er mærket som USDA-Grade eller europæisk-Grade., USDA-Grade FBS kan importeres til ethvert land fri for bovin spongiform encephalopati og mund-og klovsyge, mens europæisk-Grade FBS kan sælges i de fleste europæiske og asiatiske lande.
FBS bedste opbevares frosne, mellem -5 til -20°C, og kan være optøet ved en temperatur på mellem 2 til 8°C. Det er ofte nyttigt at prøve, og frys serum i mindre portioner, ofte 50 ml rør, for at undgå mange fryse og tø-cykler. Lejlighedsvis forbliver nogle alikvoter af FBS i en væske ved frysetemperaturer., Dette skyldes manglen på et kernedannelsescenter (partikler) for krystallisationen (frysning) at starte. Hvis du blot svirper rørene med din finger, størkner de normalt næsten øjeblikkeligt.
det er almindeligt at have noget bundfald efter optøning. Udfældningerne, sandsynligvis på grund af denaturering af nogle af serumproteinerne, kan ryddes ved kort centrifugering, og dette påvirker generelt ikke serumets kvalitet.
mange leverandører leverer FBS med forskellige kvaliteter, oprindelsesland og behandling., FBS er i sig selv en kompleks blanding, og der kan forventes variation mellem forskellige kvaliteter, leverandører og partier. Det er således vigtigt at etablere en proces til udvælgelse og evaluering af FBS. Det er en god ide at undersøge litteraturen for at bestemme, hvordan et bestemt udvalg af FBS tidligere blev brugt i lignende forskning, eller for den samme cellekultur og at være meget opmærksom på potentiel variation fra parti til parti i FBS. For at hjælpe med dette har Labome foretaget en undersøgelse af FBS-brug fra videnskabelige publikationer, diskuteret nedenfor, for at hjælpe vores besøgende med at vælge den bedst egnede FBS.,
Labome surveys litteratur for de anvendte materialer. Her opsummeres de publikationer, der citerede føtal bovint serum. Publikationerne er en tilfældig delmængde af over 10.000 publikationer.
De store leverandører af FBS er Liv Teknologier (nu en del af Thermo Fisher Scientific), Thermo Fisher Scientific Hyclone (nu en del af GE ‘ s LifeScience), og MilliporeSigma (Tabel 2).
Life Technologies er et globalt bioteknologiselskab med hovedkontor i Carlsbad, Californien., Det er dannet i 2008 med fusionen af Invitrogen Corporation og Applied Biosystems Inc. Mange af deres produkter er under varemærket Gibco. De leverer cellekulturprodukter, såsom cellekulturmedium, FBS og andre relevante reagenser. Virksomheden fusionerede med Thermo Fisher Scientific i 2014.
FBS fra Life Technologies er blevet brugt til at studere nucleolus som en fasesepareret proteinkvalitetskontrolenhed i HEK293T-og HeLa-celler ., Pandolfini L et al kulturperler HEK293T og A549 celler i DMEM suppleret med 10% Gibco FBS (10270-106) og Caco-2 celler i Eagle ‘ s Minimum Essential Medium suppleret med 20% Gibco FBS (10270-106) . HEK293T-celler opretholdes ganske ofte med 10% føtal bovint serum fra Thermo Fisher .
GE Healthcare Hyclone FBS er meget udbredt. De Cecco m Et al brugte det til 15% for at opretholde de senescent fibroblaster LF1, IMR-90 og .i-38 i Ham ‘ s F-10 Medier ., Nicetto d et al brugt Hyclone FBS (SH30071) at afslutte trypsin fordøjelse og opretholde embryonale celler . Laflamme C et al vedligeholdes HEK-293 celler i DMEM høj-glukose fra GE Healthcare (SH30081.01), der indeholder 10% kvæg kalveserum fra GE Healthcare (SH30072.03) .
Frohner DVS et al vedligeholdes Neuro-2a (N2a) og Cos-7 celler fra American Type Culture Collection i DMEM, der indeholder 10% FBS fra Bovogen, Frankrig . Laflamme C et al kulturperler U2OS celler i DMEM høj-glucose, der indeholder 10% tetracyclin-gratis føtalt bovint serum fra Wisent (081150) . Dong JX et al vedligeholdes primære hippocampus kulturer på Matrigel fra Corning med 5% føtalt bovint serum fra Atlanta Biologicals (S11550) ., Kulturperler c2c12 myoblaster med DMEM suppleret med 10% føtal bovint serum fra V .r (89510-186). Dyrkede U2OS-celler fra ATCC (HTB-96) i DMEM-medium med 10% (v/v) føtal bovint serum fra Altas Biologicals . Liu et et al dyrkede murine 4T1 celler i Dmemsupplementeret med 10% føtal bovint serum fra Biochrom .