Hvad er RNA-se??
RNA-seq (RNA-sekventering) er en teknik, der kan undersøge mængden og sekvenser af RNA i en prøve ved hjælp af next generation sequencing (NGS). Det analyserer transkriptomet af genekspressionsmønstre kodet i vores RNA. Her ser vi på, hvorfor RNA-se.er nyttigt, hvordan teknikken virker, og den grundlæggende protokol, som er almindeligt anvendt i dag1.
Hvad er anvendelserne af RNA-se??,
RNA-se.lader os undersøge og opdage transkriptomet, det samlede cellulære indhold af RNA ‘ er inklusive mRNA, rRNA og tRNA. Forståelse af transkriptomet er nøglen, hvis vi skal forbinde informationen på vores genom med dets funktionelle proteinekspression. RNA-se.kan fortælle os, hvilke gener der er tændt i en celle, hvad deres ekspressionsniveau er, og på hvilke tidspunkter de aktiveres eller slukkes2. Dette gør det muligt for forskere at dybere forstå en celles biologi og vurdere ændringer, der kan indikere sygdom., Nogle af de mest populære teknikker, der bruger RNA-se., er transkriptionel profilering, SNP-identifikation, RNA-redigering og differentiel genekspressionsanalyse3.
dette kan give forskere vigtige oplysninger om genernes funktion. For eksempel kan transkriptomet fremhæve alle de væv, hvori et gen med ukendt funktion udtrykkes, hvilket kan indikere, hvad dets rolle er. Det fanger også information om alternative splejsningshændelser (Figur 1), der producerer forskellige transkripter fra en enkelt gensekvens. Disse begivenheder ville ikke blive afhentet af DNA-sekventering., Det kan også identificere post-transkriptionelle modifikationer, der forekommer under mRNA-behandling, såsom polyadenylering og 5′ capping2.Figur 1: RNA-se.data bruger korte læsninger af mRNA, som er fri for intronisk ikke-kodende DNA. Disse læsninger skal derefter justeres tilbage til referencegenomet.
Hvordan virker RNA-se??
tidlige RNA-se.teknikker, der anvendes Sanger sekventering teknologi, en teknik, at selv om innovative på det tidspunkt, var også lav-throughput, dyrt, og unøjagtige., Det er først for nylig, med fremkomsten og udbredelsen af NGS teknologi, har vi været i stand til fuldt ud at drage fordel af RNA-seq ‘ s potential4.
det første trin i teknikken involverer konvertering af RNA-populationen til sekventering til cDNA-fragmenter (et cDNA-bibliotek). Dette gør det muligt at sætte RNA i en NGS-arbejdsgang. Adaptere tilføjes derefter til hver ende af fragmenterne. Disse adaptere indeholder funktionelle elementer, der tillader sekventering; for eksempel forstærkningselementet og det primære sekventeringssted., CDNA-biblioteket analyseres derefter af NGS, der producerer korte sekvenser, der svarer til enten en eller begge ender af fragmentet. Dybden, som biblioteket er sekventeret varierer afhængigt af teknikker, som output data vil blive brugt til. Sekventeringen følger ofte enten single-read eller parret-end sekventering metoder. Enkelt-læs sekventering er en billigere og hurtigere teknik (reference, omkring 1% af omkostningerne af Sanger-sekventering), at cDNA sekvenser fra kun den ene ende, mens parret ende metoder sekvens fra begge ender, og er derfor dyrere og tid-consuming5,6.,
der skal vælges yderligere mellem strengspecifikke og ikke-strengspecifikke protokoller. Den tidligere metode betyder, at informationen om, hvilken DNA-streng der blev transkriberet, bevares. Værdien af ekstra information opnået fra strengspecifikke protokoller gør dem til den gunstige mulighed.
disse læsninger, hvoraf der vil være mange millioner ved afslutningen af arbejdsgangen, kan derefter justeres til et genom af reference og samles for at producere et RNA-sekvenskort, der spænder over transkriptomet7.,
RNA-se.vs microarrays: hvorfor RNA-se. betragtes som overlegen
RNA-se. betragtes bredt som overlegen i forhold til andre teknologier, såsom mikroarray-hybridisering. Der er flere grunde til RNA-seq er godt betragtes status
En RNA-seq protocolExperiment Planlægning
Forberedelse, før du starter din RNA-seq eksperiment er afgørende. Spørgsmål, der skal besvares, før du starter, inkluderer10:
•hvilken metode til RNA-rensning bruger du?
•hvor mange læsninger skal du bruge?
•hvilken platform vil du bruge?,
•hvilket referencegenom vil du bruge?
•hvordan vurderer du kvaliteten af dit RNA?
•har du brug for at berige dit mål RNA?
•vil du stregkode dit RNA?
•har jeg nok biologiske og tekniske replikater?
•Single-read eller parret-end sekventering?
Forberedelse af cDNA-bibliotek
Når disse punkter er blevet overvejet, kan du begynde at forberede dit cDNA-bibliotek. Dette vil kræve tilføjelse af de platformspecifikke” adaptersekvenser “og forstærkning af DNA’ et, men den nøjagtige procedure vil være meget specifik for den platform, der bruges på dette trin., Amplifikationen af DNA involverer en revers transkriptase medieret første strengsyntese efterfulgt af en DNA-polymerase-medieret anden strengsyntese10,11.
cDNA-sekventering
når biblioteket er forberedt og adaptere tilføjet, kan du bruge din valgte sekventeringsplatform til at sekvensere dit cDNA-bibliotek til den ønskede dybde. Når dine transkriptdata er produceret, kan du kortlægge dataene til dit referencegenom., Justeringsprocessen kan kompliceres af tilstedeværelsen af splejsevarianter og modifikationer, og valget af anvendt referencegenom vil også variere, hvor vanskeligt dette trin er. Soft .arepakker som STAR er nyttige på dette stadium, ligesom kvalitetskontrolværktøjer som Picard eller STARUALIMAP12.
RNA-se.dataanalyse
efter justeringsfasen kan du fokusere på at analysere dine data. Værktøjer som Sejlfisk, RSEM og BitSE .12 hjælper dig med at kvantificere dine ekspressionsniveauer, mens værktøjer som MISO, som kvantificerer alternativt splejsede gener, er tilgængelige til mere specialiseret analyse13., Der er et bibliotek af disse værktøjer derude, og læse anmeldelser og roundups er din bedste måde at finde det rigtige værktøj til din forskning.
for at opsummere er moderne RNA-se.veletableret som den overlegne mulighed for mikroarrays og vil sandsynligvis forblive den foretrukne mulighed for tiden.
5.https://systemsbiology.columbia.edu/genome-sequencing-defining-your-experiment
6.https://emea.illumina.com/science/technology/next-generation-sequencing/paired-end-vs-single-read-sequencing.html
9.https://cofactorgenomics.com/advantages-rna-seq-over-microarray-technology/
10.http://bioinformatics.ucdavis.edu/docs/2015-june-workshop/_downloads/Th_MB_RNASeq_Intro.pdf
11.https://rnaseq.uoregon.edu/#library-prep-stranded-libraries