Differential migration af holo – og apo-metalloproteins af MIKROFONER-BN-SIDE
Mens der ikke er nogen adskillelse af holo- (Fe2-transferrin (Tf)) og apo-Tf blev observeret i konventionelle 1D native (CBB G-250 gratis)-SIDE (Fig. 1a) og SDS-side (Fig ., 1b), interessant nok fandt vi, at holo – og apo-TF er fuldstændigt adskilt ved hjælp af mikrofoner-BN-side (Fig. 1c) (det skal bemærkes, at to bånd blev observeret for en “ren” apo-TF-prøve ved hjælp af BN-side uden mikrofoner på grund af metalionforurening; supplerende fig. S1). I SDS-side skyldes dette sandsynligvis dissociationen af metalioner fra holo-former,der forekommer under stærke denatureringsbetingelser14, 15 (data ikke vist). Denne kendsgerning antyder, at den elektroforetiske genkendelse mellem holo – og apo-former ikke er tilgængelig for konventionelle SIDEMETODER., Disse resultater indebærer, at specifikke svage denatureringsmidler, som CBB-G 250 ansat i MELLEMINDKOMSTLANDE-BN-SIDE, genkende forskellen mellem holo – og apo-metalloproteins til at forbedre den adskillelse, ud over at undgå metal dissociation.
Forskellige migration adfærd for holo – og apo-former, blev også observeret for ceruloplasmin (Cp) bundet med Cu2+ (Cu-Cp) og superoxid dismutase (SOD) bundet med Cu2+ og Zn2+ (Cu/Zn-SOD) af MIKROFONER-BN-metode SIDE (Fig. 1d, e). Apo-former migrerede til positioner i tæt overensstemmelse med deres nøjagtige molekylvægte i mikrofoner-BN-side (fig., 1: TF, 77 kDa; Cp, 134 kDa; SOD, 32 kDa), hvilket er nyttigt ved identifikation af proteinerne. Som beskrevet i Introduktionsafsnittet førte disse fund os til at udvikle holo/apo-konvertering (HAC)-2D-mikrofoner-BN-side-metoden til selektiv isolering af holo-metalloproteiner.
Begrebet holo – /apo-konvertering af 2D-MIKROFONER-BN-SIDE
Vores nye 2D-SIDE-metoden er baseret på forskellen migration mellem holo – og apo-metalloproteins, begynder med en MIKROFONER-BN-SIDE etape gennemføres i to spor (baner A og B i Fig., 2, panel I) for at muliggøre adskillelse af holo – og apo-metalloproteiner fra en prøve, der indeholder begge metalloproteinformer. De to baner underkastes derefter to forskellige behandlinger efter den indledende adskillelse af mikrofoner-BN-sider: bane A udsættes for et andet mikrofoner-BN-side-trin, men først efter at have gennemgået en holo/apo-konverteringsbehandling (fig. 2 panel II-1); mens Lane B leveres til et sidetrin for metaldetektion for at bestemme metalionerne, der er forbundet med de adskilte proteiner (fig. 2 panel II-2). Den behandling, der er anvendt på Lane B, er tidligere valideret., For eksempel, bestemmelse af nogle heavy metal-ioner (Cu2+, Fe3+, Co3+, Ni2+, Mn2+ og Cd2+) i små mængde (µL) prøver på ppt og sub-ppb niveauer af denne SIDE metode uden brug af en ren værelse har været reported21. Desuden, denne tandem-1D MIKROFONER-BN-SIDE/metal afsløring SIDE metode viste, at den præcise fordeling af Cu2+ i humant serum selv for svagt albumin-bundne (udskiftelig) Cu2+ 21, og foreslog, at de periplasmic Rubrivivax gelatinosus CopI meget protein, der er involveret i kobber modstand er en kobber-bindende protein22., Det er stadig vanskeligt at identificere metalbundne proteiner i en kompleks proteinprøve på grund af co-migrerende proteiner. For eksempel har det ikke været fuldt bevist, at CopI er en kobber-bindende protein i R. gelatinosus, selv om dens sekvens har tre formodede Cu-bindende steder: (i) en type 1 kobber center til stede i mange cupredoxins som azurin og plastocyanin, (ii) en Histidin-rig-i-N-terminus sekvens og (iii) en Histidin/Methionin-rige sekvens. CopI-relaterede proteiner er til stede i mange bakterier, men er ikke bredt bevaret; for eksempel er det fraværende fra Escherichia coli22., Indtil videre er kun proteinerne fra R. gelatinosus og Vibrio cholerae blevet undersøgt og er involveret i CU-modstand22,23. I R. gelatinosus udtrykkes CopI-protein meget i nærvær af Cu2+; Cu-afgiftningsmekanismen er dog stadig ukendt. Således er en metode til isolering af metalloproteiner fra alle andre proteiner, der eksisterer i komplekse biologiske prøver, nødvendig.
Begrebet HAC-2D-MIKROFONER-BN-SIDE/metal afsløring SIDE metode., Panel i: 1D mikrofoner-BN-side i to baner. Lane A blev udsat for in-gel holo / apo konvertering procedure (som I Panel II-1), og derefter Lane A blev udsat for 2D mikrofoner-BN-side efter holo/apo konvertering (som i Panel III). Lane B blev udsat for Cu2 + og Fe3 + afsløring side (som I Panel II-2). 2D-elektroferogrammet er for en blanding af metalloproteiner (holo-TF, apo-TF, holo-Cp og holo-sod), hvor holo-metalloproteiner i den oprindelige prøve blev isoleret som pletter fra den diagonale linje (den stiplede gule linje i Panel III). Fuld størrelse versioner af elektroferogrammer repræsenteret i Fig., 2 er afbildet i Fig. S2.
for At overvinde denne begrænsning, oplysninger fra 1D MIKROFONER-BN-SIDE/metal afsløring analyse af Lane B er augmented ved at underkaste Lane En til en anden dimension af MIKROFONER-BN-SIDE efter holo – /apo-konvertering. For at udføre denne analyse gennemvædes Lane A først i en sur, metalchelatoropløsning (se afsnittet metoder og Supplerende for de detaljerede betingelser) til holo/apo-konvertering (fig. 2 panel II-1)., Dermed derivatiseres holo-metalloproteinerne til metalfrie apo-metalloproteiner i gelen på den første sidedimension. Den behandlede bane A leveres derefter til den anden MIC-BN – side-fase ved hjælp af en metalfri agarosegel (se supplerende Information). I den anden MICS-BN-side fase (Fig. 2, panel III), apo-metalloproteiner og ikke-metalloproteiner fra den oprindelige prøve migrerer på diagonallinjen, da migrationen af disse arter i den anden sidedimension er fuldstændig identisk med deres migrering i den første sidedimension., På den anden side, holo-metalloproteins fra den oprindelige prøve migrere forskellige afstande i første og andet MIKROFONER-BN-SIDE dimensioner, da disse proteiner migrere som deres holo-former i den første dimension, og som deres apo-former i den anden dimension (og da MIKROFONER-BN-SIDE resulterer i en anden elektroforetiske mobilitet for holo – og apo-former af metalloproteins; vide infra). Således vandrer kun holo-metalloproteiner fra den oprindelige prøve fra den diagonale linje i den anden dimension, der skal identificeres ved MALDI-TOF MS uden yderligere proteinrensning., De typer og mængder af metalioner, der er bundet med metalloproteiner i den oprindelige prøveopløsning (dem, der er isoleret som off-diagonale pletter), kan bestemmes ved metaldetektionsside i bane B som beskrevet ovenfor. Derfor er information vedrørende identifikation og distribution af metalloproteinarter sammen med identiteter og koncentrationer af metalioner, de binder, tilgængelig fra denne nye hac-2D-mikrofoner-BN-side/metaldetektionsside metode.,
Selektiv dyrkning af metalloproteins i HAC-2D-MIKROFONER-BN-SIDE
For proof-of-concept, HAC-2D-MIKROFONER-BN-SIDE/metal afsløring SIDE blev vist for en prøve blanding, der indeholder holo-Tf, apo-Tf, holo-Cp og holo-SOD protein standarder (hvilket resulterer i 2D electropherogram i Fig. 2, panel III), og også for en human serumprøve (supplerende Fig. S3). Pletter af holo-metalloproteiner, der migrerede fra diagonallinjen, blev med succes observeret for den blandede proteinprøve., Derudover blev Fe3+ detekteret i positionen holo-tf, og Cu2+ i positionerne holo-Cp og holo-sod, i den første MICS-BN-side-fase ved hjælp af metaldetektionsside. Hvis der ikke udføres nogen holo/apo-konvertering, migrerer alle proteinerne på den diagonale linje (supplerende fig. S5). For en human serumprøve blev holo-tf og holo-Cp med succes påvist (supplerende Fig . S3)., Det blev således konkluderet, at HAC-2D-mikrofoner-BN-side / metaldetektionsside er meget effektiv til isolering af holo-metalloproteiner og identifikation af metalioner, der oprindeligt var bundet til metalloproteiner i en proteinblanding.
Endelig, HAC-2D-MIKROFONER-BN-SIDE metode blev anvendt til en samlet bakteriel opløseligt protein fraktion opnået fra R. gelatinosus celler dyrket i overværelse af 1,2 mM Cu2+, der udtrykker CopI protein. Dette repræsenterer en biologisk proteinprøve., For denne prøve blev der fundet en plet fra den diagonale linje ved positionen 100 kDa og 29 kDa på henholdsvis første og anden side (Fig. 3a). En høj koncentration af Cu2+ blev observeret ved positionen 97-139 kDa i den første MICS-BN-side (Fig. 3b). Det blev derfor konkluderet, at proteinet på dette sted har cu ion bundet til det. Stedet blev skåret og derefter efterfølgende analyseret af MALDI-TOF MS. peptider svarende til CopI blev identificeret (fig. 3c, supplerende fig. S7 og tabel S1)., Derudover blev der observeret et enkelt bånd CopI-protein (data ikke vist), når denne gelplade blev kørt på SDS-Page. Et andet sted ud af den diagonale linje blev observeret ved omkring 40 kDa (over 29 kDa CopI stedet i den anden dimension (fig. 3a)). Det blev bekræftet af MALDI-TOF MS, at dette sted også stammede fra CopI (og sandsynligvis var en dimer af CopI i henhold til molekylvægten). Således kunne et metalloprotein isoleres specifikt fra en kompleks proteinblanding, samtidig med at det identificeres dets bundne metal., Denne analyse af HAC-2D MICS-BN-PAGE viste bestemt, at CopI er et kobberbindende protein, og interessant nok, at denne egenskab kunne relateres til proteinets Cu-afgiftende funktion i bakteriel periplasma. Yderligere kvantitative analyse viste støkiometri af Cu-ion-at CopI som 1:1 (baseret på koncentrationer af bundet Cu-ion (1.05 µM) og holo-CopI protein (0.95 µM), som bestemmes af CBB R-250 farvning). Dette er i fuld overensstemmelse med andre eksperimentelle resultater, der fandt en Cu:CopI støkiometri på 1: 1.2 ved hjælp af ICP-MS med pure CopI (Durand et al.,, ikke offentliggjorte data). Dette resultat antyder, at vores metode også er nyttig til undersøgelser af metalloprotein-støkiometrier.
HAC-2D-MIKROFONER-BN-SIDE, der beskæftiger sølv farvning (a), med Cu2+ afsløring SIDE (b), af et opløseligt fraktion opnået fra R. gelatinosus celler dyrket i overværelse af 1,2 mM Cu2+ (total protein: 31.5 µg). Den off-diagonale plet, der er angivet med stjernen i A), blev udsat for MALDI-TOF MS (supplerende Fig., S7), der identificerer sekvenserne vist i rød skrifttype som en del af CopI modne sekvens (c). Fuld størrelse versioner af elektroferogrammer repræsenteret i Fig. 3 er afbildet i supplerende Fig. S8.
Kapillær elektroforese eksperimenter for at undersøge, molekylær genkendelse tilstande
Den resolution enhancement mellem holo – og apo-former i MELLEMINDKOMSTLANDE-SIDE bistået med CBB farve (Fig., 1c-e) er en vigtig nøgle til vores metode, og interessant nok synes denne molekylære genkendelse at stamme fra forskellige antal CBB G-250 farvestofmolekyler, der binder til hver af holo – vs apo-formerne af metalloproteiner. Dette resulterer sandsynligvis i forskellige effektive ladninger og / eller inducerede steriske strukturer for farveproteinkomplekserne. Begge disse virkninger vil påvirke elektroforetisk mobilitet., For at opnå dybere indsigt i genkendelsesmekanismen for CBB G-250 farvebinding mod holo – og apo-TF blev CE-eksperimenter udført sammen med dockingsimuleringer ved hjælp af AutoDock Vina program24, 25 (vide infra). C .e udføres i fri vandig opløsning uden en gelmatri., og derfor behøver en molekylær sigtningseffekt ikke overvejes i simuleringerne. Den elektroforetiske mobilitet af holo-TF målt ved C .e var åbenlyst forskellig fra apo-TF med tilsætning af CBB-farvestoffet (fig. 4), medens disse proteiner havde identiske mobiliteter i fravær af farvestoffet., Denne kendsgerning tyder stærkt på, at antallet af farvestofmolekyler bundet med holo – og apo-metalloproteiner er anderledes. I C .e vil migrationen af proteinfarvestofkomplekset overvejende blive påvirket af den effektive ladning af komplekset, hvilket igen vil blive påvirket af antallet af enkeltladede anioniske CBB-farvestofmolekyler bundet til proteinet.,
Typisk electropherograms fra CZE eksperimenter for: 10 µM holo – eller apo-Tf uden CBB G-250 (øverste grønne spor); og blandinger, der indeholder 5 mM CBB G-250 farvestof med 10 µM holo-Tf (midterste blå spor) eller med 10 µM apo-Tf (nederste røde spor).,
Traditionelt elektroforetiske mobilitet af et protein i gratis løsning er repræsenteret ved Henry ligning, som vist i ligning (1):
Her, Q, η, R og k repræsenterer den omkostning, at den løsning, viskositet, radius af protein, og den inverse Debye-længden af elektrolyt opløsning. Henry-funktionen, H, øges monotont fra 2/3 til 1., Strengt taget gælder denne formel udelukkende for et sfærisk molekyle med en centrosymmetrisk ladningsfordeling, selvom der er nogle diskussioner om at ændre Henry-ligningen til anvendelse på ikke-sfæriske proteiner med kompleks ladningsfordeling (inklusive dipol og quaduadrupol)26. I vores tilfælde, holo – og apo-Tf-molekyler er deformeret kugler af samme størrelse (ligner kulstof med lange og korte akse længder af ca 92 og 60 Å (holo-Tf), og 93, og 68 Å (apo-Tf), henholdsvis) (Supplerende Fig. S9)., Derudover forventes dipol og quaduadrupol kun at have en mindre effekt på mobiliteten, da CBB g-250-molekylerne bundet til holo-/apo-TF ikke er lokaliserede, som vist i supplerende fig. S9 (se nedenfor). Resultaterne af præcise beregninger af Kim et al.26 viser, at elektroforetiske mobilitet af en kugle-protein er ikke væsentligt påvirket af en quadrupol i løsninger af lav ionstyrke (I < 0,01 M), og ionstyrken af adskillelse buffer i vores CZE eksperimenter var tilsvarende lave (I = 0.013 M).,
Således, forholdet mellem elektroforese mobiliteter af apo – og holo-Tf kompleks med CBB G-250 farvestof (nemlig, µApo/µHolo), er henført til forholdet mellem netto gebyrer for hver enkelt kompleks (nemlig, QApo/QHolo), som kan være let stammer fra Henry ligning. De negative nettoladninger af TF-CBB g-250-komplekser stammer hovedsageligt fra bindingsnummeret på farvestoffet. Følgelig giver værdien afapoapo /holholo også forholdet mellem farvestofnumrene (nemlig NApo/NHolo). Eksperimentelt er forholdet mellem elektroforetiske mobiliteter af de to former for Tf (apoapo /holholo = (-2.69 × 10-4)/(-2.,09 10 10-4)) blev fundet at være 1.29 af C .e (Fig. 4), hvilket svarer til forholdet mellem effektiv elektrisk ladning, forudsat at størrelserne af begge former for TF er ens. Derfor bør forholdet mellem elektroforetiske mobiliteter være i overensstemmelse med forholdet mellem farvestofmolekyler bundet. Imidlertid er yderligere diskussion af forholdet mellem elektroforetisk mobilitet og proteinform for andre metalloproteiner nødvendig i tilfælde, hvor holo – og apo-proteinformer er forskellige (som for Cp).,
molekylære dockingsimuleringseksperimenter til undersøgelse af molekylære genkendelsestilstande
Farvestofbinding blev bestemt ved fleksible molekylære dockingsimuleringer af AutoDock Vina27, designet til udtømmende at søge efter bindingssteder og beregne deres frie energier (fig. 5 og supplerende Fig. S9). For nylig, Wanang et al.25 rapporterede, at AutoDock Vina har en høj scoringskraft og mellemprøveudtagningskraft i forhold til andre udbredte dockingprogrammer., Ifølge disse simuleringer er et større antal CBB G-250 farvestofmolekyler bundet til ledige Fe-bindingssteder i apo-TF sammenlignet med holo-TF (fig. 5a) blev observeret. Baseret på disse Autodock Vina simuleringer, forholdet mellem dye-bindende række NApo/NHolo blev fundet til at være 1.23, med en bindende energi <-6.5 kcal/mol (svarende til K~104.4 M−1) (Fig. 5b til farvestof-bindende antal kumulerede frekvens fordeling som funktion af bindende energi), hvilket er i god overensstemmelse med vores CZE resultater, diskuteret tidligere (NApo/NHolo = 1.29)., Kvantitativ binding antages ved tilsætning af farvestoffet ved mM-niveauer (over 95% af bindingsstederne interagerer med farvestoffet, når log K er 4,4 eller større), som i disse forsøg.
Den bindende antallet af farvestof molekyler med holo-Tf blev også undersøgt af CZE eksperimenter (data ikke vist), som bedømt ud fra fald af gratis dye top for et 1 mM CBB G-250 farvestof prøve med og uden tilsætning af 10 µM holo-Tf., Da den bindende nummer blev målt til at være >18, den bindende antallet af NHolo blev formodes at være >20 i MELLEMINDKOMSTLANDE-BN-SIDE eksperimenter (med 3,0 mM farve tilføjet). Denne bindende antallet af farvestof molekyler (>20) fra CZE eksperimenter er i god overensstemmelse med antallet af bundne dye-molekyler (N = 21) fra molekylær docking-simuleringer, som ville give anledning til, at den forventede affinitet af -6.5 kcal/mol, og så vores resultater er selv-konsistente.,
Det er, set fra disse molekylære docking-simuleringer og CZE eksperimenter, der CBB G-250 farvestof genkender forskellige kemiske strukturer af holo – og apo-metalloproteins at give forskellige µ værdier. Mere detaljerede observationer af de simulerede bindende tilstande tyder også på, at CBB G-250 molekyle interagerer med amino syre rester tilgængeligt på grund af den mere åbne (udfoldede) apo-Tf struktur i forhold til de mere lukkede (foldet) holo-Tf struktur, mens den farve viser ingen bindende direkte med Fe-bindende aminosyrer rester (Asp392, Tyr429, Tyr517 og Hans 585)., Det antydes således, at farvestoffet genkender små forskelle mellem de foldede og udfoldede kemiske strukturer af metalloproteiner, som induceres ved binding eller dissociation af metalioner. Sådanne små forskelle kan ikke identificeres ved andre konventionelle separationsmetoder.
aminosyrerester, der kontakter farvestofmolekylet i hvert farvestofbindingssted i simuleringen (for eksempel supplerende fig. S10) blev kategoriseret efter deres dominerende karakter: hydrofob, hydrofil eller elektrostatisk ladning (som opsummeret i supplerende tabel S2 og tabel S3)., Ifølge resultaterne viste populationerne af hver type aminosyre, der interagerede med farvestofmolekyler, ingen forskel mellem holo – og apo-proteinformer (26-27% for hydrofobe, 37-40% for hydrofile, 33-35% for ladede rester i hver form). Imidlertid var antallet af hydrogenbindinger i apo-TF (i alt 33; 1,2 pr.bindingssted) signifikant større end i holo-TF (i alt 19; 0,9 pr. bindingssted). Ved fokusering på de otte bindingssteder i apo-TF, der ikke var til stede i holo-TF (supplerende tabel S3), blev antallet af H-obligationer pr.lokalitet fundet 2,1., Disse resultater tyder på, at ændringer i hydrogenbinding interaktioner er primært ansvarlig for differentiering mellem holo – og apo-Tf former, mens yderligere undersøgelse ville være nødvendig for at forstå det komplette mekanisme.