Die Entwicklung, Differenzierung und das Wachstum von Zellen und Geweben erfordern genau regulierte Muster der Genexpression. Enhancer wirken als cis-regulatorische Elemente, um sowohl die räumliche als auch die zeitliche Kontrolle der Entwicklung zu vermitteln, indem die Transkription in bestimmten Zellen aktiviert und/oder in anderen Zellen unterdrückt wird. Somit steuert die besondere Kombination von Transkriptionsfaktoren und anderen DNA-bindenden Proteinen in einem sich entwickelnden Gewebe, welche Gene in diesem Gewebe exprimiert werden. Enhancer ermöglichen die Verwendung desselben Gens in verschiedenen Prozessen in Raum und Zeit.,
Identifizierung und Charakterisierungedit
Traditionell wurden Enhancer durch Enhancer-Trap-Techniken unter Verwendung eines Reportergens oder durch vergleichende Sequenzanalyse und Computergenomik identifiziert. In genetisch nachvollziehbaren Modellen wie der Fruchtfliege Drosophila melanogaster kann beispielsweise ein Reporterkonstrukt wie das lacZ-Gen mit einem P-Element-Transposon zufällig in das Genom integriert werden. Wenn sich das Reportergen in der Nähe eines Enhancers integriert, spiegelt seine Expression das Expressionsmuster wider, das von diesem Enhancer angetrieben wird., Somit ermöglicht das Färben der Fliegen für die lacZ-Expression oder-Aktivität und das Klonen der Sequenz, die die Integrationsstelle umgibt, die Identifizierung der Enhancer-Sequenz.
Die Entwicklung genomischer und epigenomischer Technologien hat jedoch die Aussichten für die Entdeckung von cis-Regulatory Modules (CRM) dramatisch verändert., Sequenzierungsmethoden der nächsten Generation (NGS) ermöglichen jetzt Hochdurchsatz-funktionale CRM-Discovery-Assays, und die stark zunehmenden Mengen verfügbarer Daten, einschließlich groß angelegter Bibliotheken von TFBS-Motiven (Transcription Factor-Binding Site), Sammlungen kommentierter, validierter CRMs und umfangreicher epigenetischer Daten über viele Zelltypen hinweg, machen die genaue CRM-Erkennung in der Berechnung zu einem erreichbaren Ziel. Ein Beispiel für einen NGS-basierten Ansatz namens DNase-seq hat die Identifizierung von Nukleosom-erschöpften oder offenen Chromatinregionen ermöglicht, die CRM enthalten können., In jüngerer Zeit wurden Techniken wie ATAC-seq entwickelt, die weniger Ausgangsmaterial erfordern. Nucelosomenarme Regionen können in vivo durch Expression von Dam-Methylase identifiziert werden, was eine bessere Kontrolle der zelltypspezifischen Enhanceridentifikation ermöglicht.Rechenmethoden umfassen vergleichende Genomik, Clustering bekannter oder vorhergesagter TF-Bindungsstellen und überwachte maschinelle Lernansätze, die an bekannten CRMs trainiert werden., Alle diese Methoden haben sich für die CRM-Erkennung als wirksam erwiesen, aber jede hat ihre eigenen Überlegungen und Einschränkungen, und jede unterliegt einer mehr oder weniger großen Anzahl von falsch-positiven identifications.In der vergleichende genomische Ansatz, Sequenzkonservierung von nicht kodierenden Regionen, kann auf Enhancer hinweisen. Sequenzen aus mehreren Arten werden ausgerichtet und konservierte Regionen werden rechnerisch identifiziert., Identifizierte Sequenzen können dann an ein Reportergen wie grün fluoreszierendes Protein oder lacZ gebunden werden, um das In-vivo-Muster der Genexpression zu bestimmen, das durch den Enhancer erzeugt wird, wenn er in einen Embryo injiziert wird. Die mRNA-Expression des Reporters kann durch In-situ-Hybridisierung visualisiert werden, die ein direkteres Maß für die Enhanceraktivität liefert, da sie nicht der Komplexität der Translation und Proteinfaltung ausgesetzt ist., Obwohl viele Beweise auf die Sequenzkonservierung für kritische Entwicklungsverbesserer hingewiesen haben, haben andere Arbeiten gezeigt, dass die Funktion von Enhancern mit wenig oder keiner primären Sequenzkonservierung erhalten werden kann. Zum Beispiel haben die RET-Enhancer beim Menschen eine sehr geringe Sequenzerhaltung als bei Zebrafischen, dennoch erzeugen die Sequenzen beider Arten fast identische Muster der Reportergenexpression bei Zebrafischen., In ähnlicher Weise wurde bei stark divergierten Insekten (getrennt durch etwa 350 Millionen Jahre) festgestellt, dass ähnliche Genexpressionsmuster mehrerer Schlüsselgene durch ähnlich konstituierte CRMs reguliert werden, obwohl diese CRMs keine nennenswerte Sequenzkonservierung aufweisen, die durch Standardsequenzausrichtungsverfahren wie BLAST nachweisbar ist.
In der Aufteilung der insectsEdit
Die Verstärker der Feststellung von frühen Segmentierung bei Drosophila melanogaster-Embryonen sind unter den am besten charakterisiert developmental enhancers., Im frühen Fliegenembryo sind die Gap-Gen-Transkriptionsfaktoren für die Aktivierung und Unterdrückung einer Reihe von Segmentierungsgenen wie dem Paar von Genen verantwortlich. Die Spaltgene werden in Blöcken entlang der anterior-posterioren Achse der Fliege zusammen mit anderen mütterlichen Effekttranskriptionsfaktoren exprimiert, wodurch Zonen entstehen, in denen verschiedene Kombinationen von Transkriptionsfaktoren exprimiert werden. Die Paar-Regel-Gene sind durch nicht exprimierende Zellen voneinander getrennt. Darüber hinaus sind die Expressionsstreifen für verschiedene Paar-Regel-Gene um einige Zelldurchmesser voneinander versetzt., Somit erzeugen einzigartige Kombinationen der Paar-Regel-Genexpression räumliche Domänen entlang der anterior-posterioren Achse, um jedes der 14 einzelnen Segmente einzurichten. Der 480 bp Enhancer, der für das Ansteuern des scharfen Streifens zwei des Paar-Regel-Gens Even-skipped (eve) verantwortlich ist, wurde gut charakterisiert. Der Enhancer enthält 12 verschiedene Bindungsstellen für mütterliche und weibliche Gentranskriptionsfaktoren. Das Aktivieren und Unterdrücken von Sites überlappt sich nacheinander., Eve wird nur in einem engen Zellstreifen exprimiert, der hohe Konzentrationen der Aktivatoren und eine geringe Konzentration der Repressoren für diese Enhancersequenz enthält. Andere Enhancer-Regionen treiben ihre Expression in 6 anderen Streifen im Embryo an.
In Wirbeltiermusteredit
Die Festlegung von Körperachsen ist ein kritischer Schritt in der Tierentwicklung. Während der Embryonalentwicklung der Maus ist Nodal, ein transformierender Wachstumsfaktor-Beta-Superfamilienligand, ein Schlüsselgen, das sowohl an der anterior-posterioren Achse als auch an der Links-Rechts-Achse des frühen Embryos beteiligt ist., Das Nodalgen enthält zwei Enhancer: den proximalen Epiblast Enhancer (PEE) und den asymmetrischen Enhancer (ASE). Die PEE ist stromaufwärts des Knotengens und treibt die Knotenexpression in dem Teil des primitiven Streifens an, der sich in den Knoten differenziert (auch als primitiver Knoten bezeichnet). Die PEE schaltet die Knotenexpression als Reaktion auf eine Kombination von Wnt-Signalisierung plus einem zweiten, unbekannten Signal ein; Somit bindet ein Mitglied der LEF/TCF-Transkriptionsfaktorfamilie wahrscheinlich an eine TCF-Bindungsstelle in den Zellen im Knoten., Die Diffusion des Knotens vom Knoten weg bildet einen Gradienten, der dann die sich erstreckende anterior-posteriore Achse des Embryos modelliert. Die ASE ist ein intronischer Enhancer, der durch den Gabelkopfdomänentranskriptionsfaktor Fox1 gebunden ist. Zu Beginn der Entwicklung stellt die Fox1-gesteuerte Knotenexpression das viszerale Endoderm her. Später in der Entwicklung treibt die Fox1-Bindung an die ASE die Knotenexpression auf der linken Seite des lateralen Plattenmesoderms an und stellt so eine Links-Rechts-Asymmetrie her, die für die asymmetrische Organentwicklung im Mesoderm notwendig ist.,
Der Aufbau von drei Keimschichten während der Gastrulation ist ein weiterer kritischer Schritt in der Tierentwicklung. Jede der drei Keimschichten hat einzigartige Muster der Genexpression, die ihre Differenzierung und Entwicklung fördern. Das Endoderm wird früh in der Entwicklung durch Gata4-Expression spezifiziert, und Gata4 geht später zur direkten Darmmorphogenese über. Die Gata4-Expression wird im frühen Embryo durch einen intronischen Enhancer gesteuert, der einen anderen Forkhead-Domain-Transkriptionsfaktor, FoxA2, bindet., Anfangs treibt der Enhancer eine breite Genexpression im gesamten Embryo an, aber die Expression wird schnell auf das Endoderm beschränkt, was darauf hindeutet, dass andere Repressoren an seiner Restriktion beteiligt sein können. Spät in der Entwicklung beschränkt derselbe Verstärker die Expression auf die Gewebe, die Magen und Bauchspeicheldrüse werden. Ein zusätzlicher Enhancer ist verantwortlich für die Aufrechterhaltung der Gata4-Expression im Endoderm während der Zwischenstufen der Darmentwicklung.,
Multiple Enhancer fördern die Robustheit der Entwicklung.
Einige Gene, die an kritischen Entwicklungsprozessen beteiligt sind, enthalten mehrere Enhancer mit überlappender Funktion. Sekundäre Enhancer oder „Schattenverstärker“können viele Kilobasen vom primären Enhancer entfernt gefunden werden („primär“ bezieht sich normalerweise auf den ersten entdeckten Enhancer, der oft näher an dem von ihm regulierten Gen liegt). Für sich genommen steuert jeder Enhancer nahezu identische Muster der Genexpression. Sind die beiden Enhancer wirklich überflüssig?, Jüngste Arbeiten haben gezeigt, dass mehrere Enhancer es Fruchtfliegen ermöglichen, Umweltstörungen wie einen Temperaturanstieg zu überleben. Bei erhöhter Temperatur kann ein einzelner Enhancer manchmal nicht das vollständige Expressionsmuster steuern, während das Vorhandensein beider Enhancer eine normale Genexpression ermöglicht.