el gen 16S rRNA se utiliza para estudios filogenéticos, ya que está altamente conservado entre diferentes especies de bacterias y arqueas. Carl Woese (1977) fue pionero en este uso del ARNr 16S. Se sugiere que el gen 16S rRNA se puede utilizar como un reloj molecular confiable porque las secuencias de 16S rRNA de linajes bacterianos distantes se muestran para tener funcionalidades similares. Algunas archaea termofílicas (por ejemplo, Orden Thermoproteales) contienen intrones del gen rRNA 16S que se encuentran en regiones altamente conservadas y pueden afectar el recocido de cebadores» universales»., También se amplifican los ARNr mitocondriales y cloroplásticos.
El par de imprimación más común fue ideado por Weisburg et al. (1991) y actualmente se conoce como 27F y 1492R; sin embargo, para algunas aplicaciones pueden ser necesarios amplicones más cortos, por ejemplo para la secuenciación 454 con química de titanio, el par de imprimación 27F-534R que cubre V1 A V3.A menudo se usa 8F en lugar de 27F. los dos cebadores son casi idénticos, pero 27F tiene una M en lugar de una C. AGAGTTTGATCMTGGCTCAG en comparación con 8F.,
| Cebador nombre | Secuencia (5′-3′) | Ref.,td> | |
|---|---|---|---|
| 805R | GAC TAC CAG GGT ATC TAA TC | ||
| 533F | GTG CCA GCM GCC GCG GTA A | ||
| 518R | GTA TTA CCG CGG CTG CTG G | ||
| 1492R | CGG TTA CCT TGT TAC GAC TT |
PCR and NGS applicationsEdit
In addition to highly conserved primer binding sites, 16S rRNA gene sequences contain hypervariable regions that can provide species-specific signature sequences useful for identification of bacteria.,Como resultado, la secuenciación del gen 16S rRNA se ha vuelto prevalente en la microbiología médica como una alternativa rápida y barata a los métodos fenotípicos de identificación bacteriana. Aunque originalmente se utilizó para identificar bacterias, la secuenciación 16S posteriormente se encontró que era capaz de reclasificar bacterias en especies completamente nuevas, o incluso genera.It también se ha utilizado para describir nuevas especies que nunca han sido cultivadas con éxito.,Con la secuenciación de tercera generación que llega a muchos laboratorios, la identificación simultánea de miles de secuencias de ARNr 16S es posible en cuestión de horas, lo que permite estudios metagenómicos, por ejemplo, de la flora intestinal.
regiones Hipervariableseditar
el gen bacteriano 16S contiene nueve regiones hipervariables (V1–V9), que van desde unos 30 a 100 pares de bases de largo, que están involucrados en la estructura secundaria de la pequeña subunidad ribosomal., El grado de conservación varía ampliamente entre las regiones hipervariables, con regiones más conservadas que se correlacionan con la taxonomía de mayor nivel y regiones menos conservadas a niveles más bajos, como el género y las especies. Mientras que toda la secuencia 16S permite la comparación de todas las regiones hipervariables, con aproximadamente 1,500 pares de bases de largo puede ser prohibitivamente costoso para los estudios que buscan identificar o caracterizar diversas comunidades bacterianas., Estos estudios comúnmente utilizan la plataforma Illumina, que produce lecturas a tasas 50 veces y 12,000 veces menos costosas que 454 pyrosequencing y Sanger sequencing, respectivamente. Si bien es más barato y permite una cobertura comunitaria más profunda, la secuenciación de Illumina solo produce lecturas de 75 a 250 pares de bases de largo (hasta 300 pares de bases con Illumina MiSeq), y no tiene un protocolo establecido para ensamblar de manera confiable el gen completo en muestras comunitarias. Sin embargo, las regiones hipervariables completas se pueden ensamblar a partir de una sola ejecución Illumina, lo que las convierte en objetivos ideales para la plataforma.,
mientras que las regiones hipervariables 16S pueden variar dramáticamente entre bacterias, el gen 16S en su conjunto mantiene una mayor homogeneidad de longitud que su contraparte eucariota (ARN ribosomal 18S), lo que puede facilitar las alineaciones. Además, el gen 16S contiene secuencias altamente conservadas entre regiones hipervariables, lo que permite el diseño de cebadores universales que pueden producir de manera confiable las mismas secciones de la secuencia 16S en diferentes taxones. Aunque ninguna región hipervariable puede clasificar con precisión todas las bacterias desde el dominio hasta la especie, algunas pueden predecir de manera confiable niveles taxonómicos específicos., Muchos estudios comunitarios seleccionan regiones hipervariables semi-conservadas como el V4 por esta razón, ya que puede proporcionar resolución a nivel de filo con la misma precisión que el gen 16S completo. Mientras que las regiones menos conservadas luchan por clasificar nuevas especies cuando se desconoce la taxonomía de orden superior, a menudo se utilizan para detectar la presencia de patógenos específicos. En un estudio realizado por Chakravorty et al. en 2007, los autores caracterizaron las regiones V1-V8 de una variedad de patógenos con el fin de determinar qué regiones hipervariables sería más útil incluir para ensayos específicos de la enfermedad y amplios., Entre otros hallazgos, señalaron que la región V3 fue la mejor para identificar el género para todos los patógenos probados, y que V6 fue la más precisa para diferenciar especies entre todos los patógenos observados por los CDC probados, incluido el ántrax.
mientras que el análisis de la región hipervariable 16S es una herramienta poderosa para los estudios taxonómicos bacterianos, lucha por diferenciar entre especies estrechamente relacionadas. En las familias Enterobacteriaceae, Clostridiaceae y Peptostreptococcaceae, las especies pueden compartir hasta un 99% de similitud de secuencia en todo el gen 16S., Como resultado, las secuencias V4 pueden diferir solo por unos pocos nucleótidos, dejando las bases de datos de referencia incapaces de clasificar de manera confiable estas bacterias en niveles taxonómicos más bajos. Al limitar el análisis de 16S a regiones hipervariables seleccionadas, estos estudios pueden fallar en observar diferencias en taxones estrechamente relacionados y agruparlos en unidades taxonómicas únicas, subestimando así la diversidad total de la muestra. Además, los genomas bacterianos pueden albergar múltiples genes 16S, con las regiones V1, V2 y V6 que contienen la mayor diversidad intraespecie., Si bien no es el método más preciso para clasificar las especies bacterianas, el análisis de las regiones hipervariables sigue siendo una de las herramientas más útiles disponibles para los estudios de comunidades bacterianas.