migración diferencial de holo-y apo-metaloproteínas por MICS – BN-PAGE
mientras que no se separaron holo-(Fe2-transferrina (Tf)) y apo – TF observado en 1D nativo convencional (CBB G-250 Libre)-página (Fig. 1a)y SDS-PAGE (Fig., 1B), curiosamente, encontramos que holo – y apo-Tf están completamente separados por medio de MICS-BN-PAGE (Fig. 1c) (cabe señalar que se observaron dos bandas para una muestra apo-Tf «pura» utilizando BN-PAGE sin modo MICS debido a la contaminación de iones metálicos; suplemento Fig. S1). En SDS-PAGE, esto se debe probablemente a la disociación de iones metálicos de Holo-formas que ocurren bajo fuertes condiciones de desnaturalización14, 15 (datos no mostrados). Este hecho sugiere que el reconocimiento electroforético entre las formas holo y apo no está disponible para los métodos de paginación convencionales., Estos resultados implican que los agentes desnaturalizantes débiles específicos, como CBB-G 250 empleados en MICS-BN-PAGE, reconocen la diferencia entre holo – y apo-metaloproteínas para mejorar la separación, además de evitar la disociación de metales.
también se observaron diferentes comportamientos de migración para las formas holo y apo para la ceruloplasmina (Cp) unida a Cu2+ (Cu – Cp) y la superóxido dismutasa (SOD) unida a Cu2+ y Zn2+ (Cu/Zn-SOD) por el método MICS-BN-PAGE (Fig. 1d, e). Las formas Apo migraron a posiciones en estrecha correspondencia con sus pesos moleculares precisos en MICS-BN-PAGE (Fig., 1: Tf, 77 kDa; Cp, 134 kDa; SOD, 32 kDa), que es útil para identificar las proteínas. Como se describe en la sección de introducción, estos hallazgos nos llevaron a desarrollar la metodología de conversión holo/apo (HAC)-2D MICS-BN-PAGE para el aislamiento selectivo de holo-metaloproteínas.
concepto de conversión de Holo / apo 2D MICS-BN-PAGE
nuestro nuevo método de página 2D basado en la migración diferencial entre Holo-y APO-metaloproteínas, comienza con una etapa de MICS-BN-PAGE realizada en dos carriles (carriles A y B en la Fig., 2, panel I) to allow for the separation of holo – and apo-metalloproteins from a sample containing both metaloprotein forms. Los dos carriles se someten a dos tratamientos diferentes después de la separación inicial de MICS-BN-PAGE: El Carril A se somete a una segunda etapa de MICS-BN-PAGE, pero solo después de someterse a un tratamiento de conversión holo/apo (Fig. 2 panel II-1); mientras que el carril B se entrega a una etapa de Página de detección de metales para determinar los iones metálicos asociados con las proteínas separadas (Fig. 2 Grupo II-2). El tratamiento aplicado al carril B ha sido previamente validado., Por ejemplo, se ha informado de la determinación de algunos iones de metales pesados (Cu2+, Fe3+, Co3+, Ni2+, Mn2+ y Cd2+) en muestras de pequeño volumen (µL) a niveles ppt y sub-ppb mediante este método de página sin el uso de una sala limpia21. Además, esta metodología en tándem 1D MICS-BN-PAGE/metal detection PAGE reveló la distribución precisa de Cu2 + en suero humano incluso para Cu2+ 21 débilmente unido a albúmina (intercambiable), y sugirió que la proteína periplásmica Rubrivivax gelatinosus CopI altamente involucrada en la resistencia al cobre es una proteína de unión al cobre 22., Aún así, identificar completamente las proteínas unidas a metales en una muestra compleja de proteínas es difícil debido a las proteínas co-migratorias. Por ejemplo, no se ha demostrado completamente que CopI sea una proteína de unión al cobre en R. gelatinosus, aunque su secuencia tiene tres sitios putativos de unión al Cu: (i) un centro de cobre tipo 1 presente en muchas cupredoxinas como la Azurina y la plastocianina, (ii) una secuencia N-terminal rica en histidina y (iii) una secuencia rica en histidina/metionina. Las proteínas relacionadas con CopI están presentes en muchas bacterias, pero no se conservan ampliamente; por ejemplo, está ausente de Escherichia coli22., Hasta ahora,solo las proteínas de R. gelatinosus y Vibrio cholerae han sido estudiadas y están involucradas en la resistencia de Cu22, 23. En R. gelatinosus, la proteína CopI se expresa altamente en presencia de Cu2+; sin embargo, el mecanismo de desintoxicación de Cu es aún desconocido. Por lo tanto, es necesario un método para el aislamiento de metaloproteínas de todas las demás proteínas que coexisten en muestras biológicas complejas.
concepto de la metodología HAC-2D MICS-BN-PAGE/metal detection PAGE., Panel I: micros 1D-BN-página en dos carriles. El carril a se sometió al procedimiento de conversión Holo/apo en gel (como en el Panel II-1), y luego el carril A se sometió a 2D MICS-BN-PAGE después de la conversión holo/apo (como en el Panel III). El carril B fue sometido a la página de detección Cu2+ y Fe3+ (como en el Panel II-2). El electropherograma 2D es para una mezcla de metaloproteínas (holo-Tf, apo-TF, Holo-Cp y holo-SOD), en el que las holo-metaloproteínas de la muestra original se aislaron como puntos fuera de la línea diagonal (la línea amarilla punteada en el Panel III). Versiones de tamaño completo de electropherogramas representados en la Fig., 2 se representan en la Fig. S2.
para superar esta limitación, la información proporcionada por el análisis de Página de detección de metales/MICS-BN-PAGE 1D del carril B se aumenta sometiendo el carril a a una segunda dimensión de MICS-BN-PAGE después de la conversión holo/apo. Para efectuar este análisis, El Carril a se sumerge primero en una solución quelante de metal ácida (ver sección Métodos y suplementario para las condiciones detalladas) para la conversión holo/apo (Fig. 2 panel II-1)., Al hacerlo, las holo-metaloproteínas se derivatizan en apo-metaloproteínas libres de metal en el gel de la dimensión de la primera página. El carril a Tratado se entrega entonces a la segunda etapa MICS-BN-PAGE con la ayuda de un gel de agarosa libre de metal (ver información complementaria). En la segunda etapa MICS-BN-PAGE (Fig. 2, panel III), Las apo-metaloproteínas y no metaloproteínas de la muestra original migran en la línea diagonal, ya que la migración de estas especies en la dimensión de segunda página es completamente idéntica a su migración en la dimensión de primera página., Por otro lado, las holo-metaloproteínas de la muestra original migran diferentes distancias en la primera y segunda dimensión MICS-BN-PAGE, ya que estas proteínas migran como sus Holo-formas en la primera dimensión y como sus APO-formas en la segunda dimensión (y ya que MICS-BN-PAGE resulta en una movilidad electroforética diferente para las Holo – y apo-formas de metaloproteínas; vide infra). Por lo tanto, solo las holo-metaloproteínas de la muestra original migran fuera de la línea diagonal en la segunda dimensión, para ser identificadas por MALDI-TOF MS sin ninguna purificación de proteína adicional., Los tipos y cantidades de iones metálicos unidos con metaloproteínas en la solución de muestra original (los aislados como puntos fuera de la diagonal), pueden determinarse mediante la página de detección de metales del carril B, como se describió anteriormente. Por lo tanto, la información relativa a la identificación y distribución de especies de metaloproteínas, junto con las identidades y concentraciones de iones metálicos a los que se unen, es accesible desde esta nueva metodología HAC-2D MICS-BN-PAGE/metal detection PAGE.,
aislamiento selectivo de metaloproteínas en HAC-2D MICS-BN-PAGE
para la prueba de concepto, se demostró HAC-2D MICS-BN-PAGE / metal detection PAGE para una mezcla de muestra que contiene estándares de proteínas holo-Tf, apo-Tf, Holo-Cp y holo-SOD (resultando en el electropherograma 2D en la Fig. 2, panel III), y también para una muestra de suero humano (suplemento Fig. S3). Se observaron con éxito manchas de holo-metaloproteínas que migraron fuera de la línea diagonal para la muestra de proteína mixta., Además, se detectó Fe3+ en la posición de holo-Tf, y Cu2+ en las posiciones de holo-Cp y holo-SOD, en la primera etapa de MICS-BN-PAGE utilizando la página de detección de metales. Si no se realiza la conversión holo / apo, todas las proteínas migran en la línea diagonal (suplemento Fig. S5). Para una muestra de suero humano, se detectaron con éxito holo-Tf y holo-Cp (suplemento Fig. S3)., Por lo tanto, se concluyó que hac-2D MICS-BN-PAGE/metal detection PAGE es muy eficaz para el aislamiento de holo-metaloproteínas y la identificación de iones metálicos originalmente Unidos a metaloproteínas en una mezcla de proteínas.
finalmente, se aplicó el método HAC-2D MICS-BN-PAGE a una fracción total de proteína soluble bacteriana obtenida de células R. gelatinosus cultivadas en presencia de 1,2 mM Cu2+, expresando proteína CopI. Esto representa una muestra de proteína biológica., Para esta muestra, se encontró un punto fuera de la línea diagonal en la posición de 100 kDa y 29 kDa en la primera y segunda página, respectivamente (Fig. 3a). Se observó una alta concentración de Cu2+ en la posición de 97-139 kDa en la primera página de MICS-BN (Fig. 3b). En consecuencia, se concluyó que la proteína en este punto se ha unido al ion Cu. La Mancha fue cortada y posteriormente analizada por MALDI-TOF MS. se identificaron péptidos correspondientes a CopI (Fig. 3C, suplemento Fig. S7 y cuadro S1)., Además, cuando esta mancha de gel se ejecutó en SDS-PAGE, se observó una sola banda de proteína CopI (no se muestran los datos). Otro punto fuera de la línea diagonal se observó alrededor de 40 kDa (por encima del punto CopI de 29 kDa en la segunda dimensión (Fig. 3a)). Fue confirmado por MALDI-TOF MS que este punto también se originó de CopI (y era probablemente un dímero de CopI según el peso molecular). Por lo tanto, una metaloproteína podría aislarse específicamente de una mezcla compleja de proteínas al mismo tiempo que identifica su metal Unido., Este análisis de HAC – 2D MICS-BN-PAGE definitivamente demostró que CopI es una proteína de unión de cobre, y curiosamente, que esta propiedad podría estar relacionada con la función desintoxicante de la proteína Cu en el periplasma bacteriano. El análisis cuantitativo posterior reveló la estequiometría del ion Cu a CopI como 1: 1 (basado en las concentraciones del ion cu Unido (1.05 µM) y de la proteína Holo-CopI (0.95 µM) según lo determinado por la tinción CBB R-250). Esto está en total concordancia con otros resultados experimentales, que encontraron una estequiometría Cu: CopI de 1: 1.2 utilizando ICP-MS con CopI puro (Durand et al.,, datos no publicados). Este resultado sugiere que nuestro método también es útil para investigaciones de estequiometrías de metaloproteínas.
HAC-2D MICS-BN-PAGE employing silver staining (a), with Cu2+ detection PAGE (b), of a soluble fraction obtained from R. células gelatinosas cultivadas en presencia de 1,2 mm CU2+ (proteína total: 31,5 µg). El punto fuera de la diagonal indicado por el asterisco en (a) se sometió a MALDI-TOF MS (Fig., S7), identificando las secuencias mostradas en fuente roja como parte de la secuencia CopI mature (c). Versiones de tamaño completo de electropherogramas representados en la Fig. 3 se representan en la Fig. S8.
experimentos de electroforesis capilar para investigar los modos de reconocimiento molecular
la mejora de la resolución entre las formas holo y apo en MICS – PAGE asistida con tinte CBB (Fig., 1c-e) es una clave importante para nuestra metodología, y, curiosamente, este reconocimiento molecular parece originarse de diferentes números de moléculas de tinte CBB G – 250 que se unen a cada una de las formas holo vs.apo de metaloproteínas. Esto, a su vez, probablemente resulta en diferentes cargas efectivas, y/o estructuras estéricas inducidas, para los complejos de proteína de tinte. Ambos efectos afectarían la movilidad electroforética., Para obtener una visión más profunda sobre el mecanismo de reconocimiento de CBB G – 250 dye binding hacia holo-y apo-TF, se llevaron a cabo experimentos CE, junto con simulaciones de acoplamiento utilizando el programa AutoDock Vina 24,25 (vide infra). CZE se lleva a cabo en solución acuosa libre sin una matriz de gel, por lo que no es necesario considerar un efecto de tamizado molecular en las simulaciones. La movilidad electroforética de holo-Tf medida por CZE fue obviamente diferente de la de apo-Tf con la adición del tinte CBB (Fig. 4), mientras que estas proteínas tenían movilidad idéntica en ausencia del tinte., Este hecho sugiere fuertemente que el número de moléculas de tinte unidas con holo – y apo-metaloproteínas es diferente. En CZE, la migración del complejo proteína-tinte se vería afectada predominantemente por la carga efectiva del complejo, que, a su vez, se vería afectada por el número de moléculas de tinte aniónico CBB cargadas individualmente unidas a la proteína.,
electropherogramas típicos de experimentos CZE para: holo – o apo-TF de 10 µM sin CBB G-250 (traza verde superior); y mezclas que contengan 5 mm de colorante CBB g-250 con 10 µm Holo-TF (traza azul central) o con 10 µm APO-TF (traza Roja inferior).,
tradicionalmente, la movilidad electroforética de una proteína en solución libre está representada por la ecuación de Henry, como se muestra en la ecuación (1):
aquí, q, η, r y K representan la carga neta, la viscosidad de la solución, el radio de la proteína y la longitud inversa de Debye de la solución electrolítica. La función de Henry, H, aumenta monótonamente de 2/3 a 1., Estrictamente hablando, esta fórmula se aplica exclusivamente a una molécula esférica con una distribución de carga centrosimétrica, aunque hay algunas discusiones para modificar la ecuación de Henry para aplicarla a proteínas no esféricas con distribución de carga compleja (incluyendo dipolo y cuadrupolo)26. En nuestro caso, las moléculas holo-y apo-TF son esferas deformadas de tamaño muy similar (se asemejan a esferoides con ejes largos y cortos de aproximadamente 92 y 60 Å (holo-Tf), y 93 y 68 Å (apo-TF), respectivamente) (Fig.suplementaria. S9)., Además, se espera que el dipolo y el cuadrupolo tengan solo un efecto menor en la movilidad, ya que las moléculas CBB G-250 unidas a holo-/apo-Tf no están localizadas, como se muestra en la Fig. S9 (véase INFRA). Los resultados de cálculos precisos de Kim et al.26 muestran que la movilidad electroforética de una proteína esferoidal no se ve afectada significativamente por un cuadrupolo en soluciones de baja fuerza iónica (i < 0.01 M), y la fuerza iónica del tampón de separación en nuestros experimentos CZE fue similarmente baja (i = 0.013 M).,
Por lo tanto, la relación de las movilidades electroforéticas de apo – y holo-Tf complejados con CBB g-250 tinte (a saber, µApo/µHolo), se atribuye a la relación de las cargas netas de cada complejo (a saber, QApo / QHolo), que puede derivarse fácilmente de la ecuación de Henry. Las cargas netas negativas de los complejos TF-CBB G-250 se originan principalmente del número de unión del tinte. En consecuencia, el valor de µApo / µHolo también da la relación de los números de tinte (a saber, NApo/NHolo). Experimentalmente, la relación de las movilidades electroforéticas de las dos formas de Tf (µApo / µHolo = (-2.69 × 10-4)/(-2.,09 × 10-4)) fue encontrado para ser 1.29 por CZE (Fig. 4), que corresponde a la relación de carga eléctrica efectiva, siempre que los tamaños de ambas formas de Tf sean similares. Por lo tanto, la proporción de movilidades electroforéticas debe estar de acuerdo con la proporción de moléculas de tinte Unidas. Sin embargo, la discusión adicional de la relación entre la movilidad electroforética y la forma de la proteína para otras metaloproteínas es necesaria en los casos en que las formas de la Holo – y apo-proteína difieren (como para Cp).,
los experimentos de simulación de acoplamiento Molecular para investigar los modos de reconocimiento molecular
La Unión de tinte se determinó mediante simulaciones de acoplamiento molecular flexible de AutoDock Vina27, diseñadas para buscar exhaustivamente los sitios de unión y calcular sus energías libres (Fig. 5 y suplemento Fig. S9). Recientemente, Wang et al.25 informó que AutoDock Vina tiene un alto poder de puntuación y un poder de muestreo Intermedio en relación con otros programas de acoplamiento ampliamente utilizados., De acuerdo con estas simulaciones, un mayor número de moléculas de tinte CBB G-250 unidas a sitios de unión de Fe vacantes en apo-Tf en comparación con holo-Tf (Fig. 5a). Basado en estas simulaciones de Vina Autodock, la relación del número de unión de tinte NApo/NHolo se encontró que era 1.23, con una energía de unión < -6.5 kcal / mol (correspondiente a K~104.4 M-1) (Fig. 5b para la distribución de frecuencia acumulativa del número de unión al tinte en función de la energía de unión), que está en buen acuerdo con nuestros resultados de CZE, discutidos anteriormente (NApo/NHolo = 1.29)., La Unión cuantitativa se presume con la adición del tinte a niveles de mM (más del 95% de los sitios de unión interactúan con el tinte cuando log K es 4.4 o mayor), como en estos experimentos.
el número de unión de moléculas de tinte con holo-Tf también fue investigado por experimentos de CZE (datos no mostrados), según se juzga a partir de la disminución del pico de tinte libre para una muestra de tinte CBB G-250 de 1 mM con y sin la adición de holo-Tf de 10 µM., Dado que el número de unión se midió para ser >18, El número de unión de NHolo se presumió para ser >20 en los experimentos MICS-BN-PAGE (con tinte de 3,0 mM añadido). Este número de unión de moléculas de colorante (> 20) de los experimentos de CZE está en buen acuerdo con el número de moléculas de colorante Unidas (N = 21) de las simulaciones de acoplamiento molecular que daría lugar a la afinidad predicha de -6,5 kcal/mol, por lo que nuestros resultados son auto-consistentes.,
se ve a partir de estas simulaciones de acoplamiento molecular y experimentos CZE que CBB g-250 dye reconoce las diferentes estructuras químicas de holo – y APO-metaloproteínas para producir diferentes valores µ. Observaciones más detalladas de los modos de unión simulados también sugieren que la molécula CBB G-250 interactúa con residuos de aminoácidos accesibles debido a la estructura apo-Tf más abierta (desplegada) en comparación con la estructura holo-Tf más cerrada (plegada), mientras que el tinte no muestra unión directa con residuos de aminoácidos de unión a Fe (Asp392, Tyr429, Tyr517 y His 585)., Por lo tanto, se implica que el tinte reconoce pequeñas diferencias entre las estructuras químicas plegadas y desplegadas de las metaloproteínas, que son inducidas por la Unión o disociación de iones metálicos. Estas pequeñas diferencias no pueden ser identificadas por ningún otro método de separación convencional.
residuos de aminoácidos que entran en contacto con la molécula de tinte en cada sitio de unión del tinte en la simulación (por ejemplo, suplemento Fig. S10) se clasificaron según su naturaleza dominante: carga hidrofóbica, hidrofílica o electrostática (como se resume en las tablas suplementarias S2 y S3)., De acuerdo con los resultados, las poblaciones de cada tipo de aminoácido que interactúan con moléculas de tinte no mostraron diferencia entre las formas Holo y apoproteína (26-27% para hidrofóbicas, 37-40% para hidrofílicas, 33-35% para residuos cargados en cada forma). Sin embargo, el número de enlaces de hidrógeno en apo-Tf (33 en total; 1,2 por sitio de unión) fue significativamente mayor que en holo-Tf (19 en total; 0,9 por sitio de unión). Al enfocarse en los ocho sitios de unión en apo-Tf que no estaban presentes en holo-Tf (tabla suplementaria S3), el número de enlaces H por sitio fue de 2.1., Estos resultados sugieren fuertemente que los cambios en las interacciones de los enlaces de hidrógeno son los principales responsables de la diferenciación entre las formas holo y apo – Tf, mientras que se necesitaría más investigación para comprender el mecanismo completo.