migración diferencial de holo-y apo-metaloproteínas por MICS – BN-PAGE
mientras que no se separaron holo-(Fe2-transferrina (Tf)) y apo – TF observado en 1D nativo convencional (CBB G-250 Libre)-página (Fig. 1a)y SDS-PAGE (Fig., 1B), curiosamente, encontramos que holo – y apo-Tf están completamente separados por medio de MICS-BN-PAGE (Fig. 1c) (cabe señalar que se observaron dos bandas para una muestra apo-Tf «pura» utilizando BN-PAGE sin modo MICS debido a la contaminación de iones metálicos; suplemento Fig. S1). En SDS-PAGE, esto se debe probablemente a la disociación de iones metálicos de Holo-formas que ocurren bajo fuertes condiciones de desnaturalización14, 15 (datos no mostrados). Este hecho sugiere que el reconocimiento electroforético entre las formas holo y apo no está disponible para los métodos de paginación convencionales., Estos resultados implican que los agentes desnaturalizantes débiles específicos, como CBB-G 250 empleados en MICS-BN-PAGE, reconocen la diferencia entre holo – y apo-metaloproteínas para mejorar la separación, además de evitar la disociación de metales.
también se observaron diferentes comportamientos de migración para las formas holo y apo para la ceruloplasmina (Cp) unida a Cu2+ (Cu – Cp) y la superóxido dismutasa (SOD) unida a Cu2+ y Zn2+ (Cu/Zn-SOD) por el método MICS-BN-PAGE (Fig. 1d, e). Las formas Apo migraron a posiciones en estrecha correspondencia con sus pesos moleculares precisos en MICS-BN-PAGE (Fig., 1: Tf, 77 kDa; Cp, 134 kDa; SOD, 32 kDa), que es útil para identificar las proteínas. Como se describe en la sección de introducción, estos hallazgos nos llevaron a desarrollar la metodología de conversión holo/apo (HAC)-2D MICS-BN-PAGE para el aislamiento selectivo de holo-metaloproteínas.
concepto de conversión de Holo / apo 2D MICS-BN-PAGE
nuestro nuevo método de página 2D basado en la migración diferencial entre Holo-y APO-metaloproteínas, comienza con una etapa de MICS-BN-PAGE realizada en dos carriles (carriles A y B en la Fig., 2, panel I) to allow for the separation of holo – and apo-metalloproteins from a sample containing both metaloprotein forms. Los dos carriles se someten a dos tratamientos diferentes después de la separación inicial de MICS-BN-PAGE: El Carril A se somete a una segunda etapa de MICS-BN-PAGE, pero solo después de someterse a un tratamiento de conversión holo/apo (Fig. 2 panel II-1); mientras que el carril B se entrega a una etapa de Página de detección de metales para determinar los iones metálicos asociados con las proteínas separadas (Fig. 2 Grupo II-2). El tratamiento aplicado al carril B ha sido previamente validado., Por ejemplo, se ha informado de la determinación de algunos iones de metales pesados (Cu2+, Fe3+, Co3+, Ni2+, Mn2+ y Cd2+) en muestras de pequeño volumen (µL) a niveles ppt y sub-ppb mediante este método de página sin el uso de una sala limpia21. Además, esta metodología en tándem 1D MICS-BN-PAGE/metal detection PAGE reveló la distribución precisa de Cu2 + en suero humano incluso para Cu2+ 21 débilmente unido a albúmina (intercambiable), y sugirió que la proteína periplásmica Rubrivivax gelatinosus CopI altamente involucrada en la resistencia al cobre es una proteína de unión al cobre 22., Aún así, identificar completamente las proteínas unidas a metales en una muestra compleja de proteínas es difícil debido a las proteínas co-migratorias. Por ejemplo, no se ha demostrado completamente que CopI sea una proteína de unión al cobre en R. gelatinosus, aunque su secuencia tiene tres sitios putativos de unión al Cu: (i) un centro de cobre tipo 1 presente en muchas cupredoxinas como la Azurina y la plastocianina, (ii) una secuencia N-terminal rica en histidina y (iii) una secuencia rica en histidina/metionina. Las proteínas relacionadas con CopI están presentes en muchas bacterias, pero no se conservan ampliamente; por ejemplo, está ausente de Escherichia coli22., Hasta ahora,solo las proteínas de R. gelatinosus y Vibrio cholerae han sido estudiadas y están involucradas en la resistencia de Cu22, 23. En R. gelatinosus, la proteína CopI se expresa altamente en presencia de Cu2+; sin embargo, el mecanismo de desintoxicación de Cu es aún desconocido. Por lo tanto, es necesario un método para el aislamiento de metaloproteínas de todas las demás proteínas que coexisten en muestras biológicas complejas.