informes oncológicos

Introducción

Las especies reactivas de oxígeno (ROS) son moléculas altamente inestables y reactivas que contienen fracciones de oxígeno. Incluyen peróxido de hidrogeno (H2O2), anión superóxido(O2●−) y radical hidroxilo (●OH).Aunque los ROS son reconocidos como agentes citotóxicos, pueden servir como mensajeros secundarios para controlar muchos eventos celulares de expresión génica, diferenciación, proliferación celular y muerte celular(1,2)., Las ROS son generadas continuamente por el metabolismo aeróbico endógeno dentro de las células en forma de O2● – y / o son hechas a propósito por oxidasas,tales como las oxidasas de nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADPH) y xantina oxidasa (3).O2● – es convertido toH2O2 por la enzima superóxido dismutasa(4). El H2O2 es procesado posteriormente en O2 y H2O por catalasa o glutatión peroxidasas (5).En comparación con otros miembros de ROS, no radicalH2O2 es capaz de penetrar libremente en las membranas celulares, e interactúa con el hierro ferroso (química de Fenton),que produce el altamente destructivo y de corta duración●OH., La producción de diferentes formas de ROS en varios niveles puede ser útil o perjudicial para las células y los tejidos.En particular, cantidades excesivas de ROS pueden ser el resultado de su sobreproducción y / o regulación a la baja de antioxidantes.El aumento de los niveles de ROS puede resultar en daños al ADN, proteínas ylípidos en las células, implicándolos en la etiología de varias enfermedades humanas, incluyendo el cáncer (6-9).

la Apoptosis es muerte celular programada y se produce a través de dos vías diferentes: la vía intrínseca mitocondrial y la vía extrínseca mediada por el receptor (10)., El paso clave en la apoptosis mediada por la mitocondria es la translocación de cytochromec de la mitocondria al citosol y su interacción subsecuente con Apaf-1 y caspasa-9 para formar un complejo(apoptosoma). El apoptosoma activa aún más la caspasa Ejecutiva-3, -6 y -7 (11). Por el contrario, la vía extrínseca comienza con la Unión de ligandos específicos, como TNF-α, TRAIL y Fas a los respectivos receptores de muerte celular, que estimulan las actividades de caspasa-8 y -3 (12)., Caspasa-8 escinde BID, proteína citosólica aproapoptótica de la familia Bcl-2, para generar un producto truncado, tBID que entra en las mitocondrias y disminuye el potencial de la membrana mitocondrial (MMP;ΔΨm), causando la liberación de citocromo C. Latranslocación de otra proteína apoptótica, Bax del citosol a la mitocondria también desencadena una pérdida similar de MMP(ΔΨm). Caspasa-3 es la caspasa ejecutiva clave; su activación puede desmontar sistemáticamente la integridad de las células a través de la escisión de varias proteínas clave, como la poli(ADP-ribosa)polimerasa (PARP) y RhoGDI.,

Los pulmones son susceptibles a una variedad de lesiones aerotransportadas y transmitidas por sangre que, en consecuencia, pueden causar fibrosis pulmonar y cáncer (13). Se considera que la carcinogénesis del cáncer de pulmón está estrechamente relacionada con la inflamación tisular mediada por H2O2. Durante la inflamación, se espera que las concentraciones tisulares de H2O2 alcancen niveles casi milimolares, mientras que se supone que los niveles bajos de H2O2 producidos por las oxidasde NADPH en condiciones normales no tienen un mayor efecto que el microambiente de la membrana plasmática, como los lipidrafts (14,15)., Sin embargo,en ambos casos, el H2O2 puede modular las funciones celulares vitales de proliferación, muerte y diferenciación celular al cambiar las señales y la expresión génica y sus niveles más altos pueden conducir a una poptosis y/o necrosis. El H2O2 exógeno se utiliza con frecuencia como ROS representativos para simular el estrés oxidativo en células y tejidos. El H2O2 es relativamente no tóxico para las células normales de las células veinendoteliales umbilicales humanas y las células musculares lisas de la arteria pulmonar humana(16,17). H2O2-triggeredcell death in lung cancer cells may have citotoxicological researchinterest.,

en el presente estudio, se evaluaron los efectos moleculares del H2O2 exógeno sobre las células de cáncer pulmonar Calu-6 y A549 con respecto al crecimiento y muerte celular, así como los efectos antiapoptóticos de varios inhibidores de la caspasa en células de cáncer pulmonar tratadas con H2O2.,

materiales y métodos

cultivo celular

Las líneas celulares de cáncer de pulmón humano Calu-6 y A549 fueron compradas al Korean Cell Line Bank (Seúl, Corea) y se cultivaron en medio RPMI-1640 suplementado con suero fetalbovine al 10% (FBS; Sigma-Aldrich; Merck KGaA, Darmstadt, Alemania)y penicilina-estreptomicina al 1% (Gibco-BRL; Thermo fisherscientific, Inc., Waltham, MA, USA). Estas células se cultivaron regularmente en platos de cultivo de tejidos plásticos de 100 mm (Nunc, Roskilde,Dinamarca) y se cosecharon con una solución de tripsina-EDTA (Gibco-BRL;Thermo Fisher Scientific, Inc.).,

reactivos

crecimiento celular y número de células los ensayos

los cambios en el crecimiento celular se evaluaron mediante la evaluación de la absorbancia de colorante de bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-Il)-2, 5-difeniltetrazolio (MTT;Sigma-Aldrich; Merck KGaA) como se describió anteriormente(19). El número de células viables y muertas se determinó mediante el método de tinción de células azules de tripano (20). Las células se expusieron a las cantidades designadas de H2O2 con o sin 15 µM de cada inhibidor de la aspasa durante 24 h.,

ciclo celular y análisis celular sub-G1

el ciclo celular y el análisis celular sub-G1 se realizaron mediante tinción de yoduro de propidio (PI; Sigma-Aldrich; Merck KGaA) previamente descrita (20). Las células estuvieron expuestas a las cantidades designadas de H2O2 con o sin 15 µM de cada inhibidor de caspas durante 24 h. las distribuciones del ciclo celular se analizaron con un citómetro de flujo aFACStar (Becton-Dickinson and Company, FranklinLakes, NJ, EE.UU.).,

tinción de anexina V-FITC para detección de muerte celular

la muerte celular apoptótica se verificó midiendo las células teñidas con anexina V-fluoresceína isotiocianato (FITC;Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.) como se describió anteriormente (20). Las células se expusieron a las cantidades designadas de H2O2 con o sin 15 µm de cada inhibidor de la caspasa durante 24 h. la tinción de anexina V-FITC se analizó con un citómetro de flujo FACStar (Becton-Dickinson andCompany).,

la evaluación de MMP(ΔΨm)

MMP (ΔΨm) se evaluó mediante un colorante fluorescente de rodamina 123 (Sigma-Aldrich; Merck KGaA) como se describió anteriormente (21). Las células se expusieron a las cantidades designadas de H2O2 con o sin 15 µM de cada inhibidor de caspasa durante 24 h. la intensidad de la tinción de rodamina 123 se analizó mediante un citómetro de flujo FACStar(Becton-Dickinson and Company). La ausencia de rodamina 123 de las células indicó la pérdida de MMP (ΔΨm) en células de cáncer pulmonar., Los niveles de MMP (ΔΨm) en células sin incluir las células con pérdida de MMP(ΔΨm) se expresaron como la intensidad fluorescente media, que fue estimada por el software CellQuest (versión 5.1;Becton-Dickinson and Company).

análisis de Western blot

los cambios en las células tratadas con Bcl-2, caspasa-3 y PARP inH2O2 se analizaron mediante westernblotting. Brevemente, se incubaron 1×106 células en una placa de cultivo de 60 mm(Nunc) con las cantidades designadas de H2O2 durante 24 h. Las muestras que contenían 20 µg de proteína total se separaron por 8 o 12.,Gel SDS-PAGE al 5%, transferido a membranas de PVDF immobilon-P (EMD Millipore, Billerica, MA, EE. UU.) por electro-Blotting y luego sondeado con anticuerpos anti-Bcl-2, Anti-caspasa-3,anti-PARP y anti-β-actina (dilución 1:5,000; Santa CruzBiotechnology, Santa Cruz, CA, EE. UU.). Las membranas fueron tratadas con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de horseradish (dilución 1: 5,000; Cell signaling Technology, Inc.). Los Blots fueron desarrollados por medio de un kit ECL (Amersham Life Science, Arlington Heights, IL,USA).,

cuantificación de las actividades de caspasa-3 y −8

Las actividades de caspasa-3 y -8 fueron evaluadas por los kits de ensayo colorimétrico de caspasa-3 y -8 (R & D Systems, Inc.) descrito anteriormente (20). Enbrief, 1×106 células en placa de cultivo de 60 mm (Nunc) fueron tratadas con 75 µM H2O2 durante 24 h. Se utilizaron muestras que contenían 50 µg de proteína total para evaluar las actividades de caspasa-3 y-8.

análisis estadístico

mediante el software InStat (GraphPad Prism4; GraphPad Software, Inc.,, San Diego, CA, USA). Para los datos paramétricos se utilizó la prueba t del estudio o Análisis de varianza unidireccional (ANOVA) con análisis posthoc utilizando la prueba de comparación múltiple de Tukey. Se consideró que P<0,05 indicaba una diferencia astáticamente significativa.

resultados

H2O2 afecta el crecimiento celular y la distribución del ciclo en células de cáncer de pulmón

Los efectos celulares de H2O2 en el crecimiento de células de cáncer de pulmón se examinaron a las 24 h., El tratamiento con 50-250 µM H2O2 redujo significativamente las células Calu-6 viables (Trypan blue negativo) y aumentó las células muertas (Trypan Blue positivo) de forma dosis-dependiente (Fig. 1A). Sobre la base de los ensayos MTT, 50-250 µMH2O2 atenuaron significativamente el crecimiento de células Calu-6 con una CI50 de ~50 µM (Fig. 1B). Cuando se examinó la distribución del ciclo celular en células Calu-6 tratadas con H2O2,las células Calu-6 tratadas con H2O2 de 75 µM demostraron una detención significativa de la fase G1 del ciclo celular en comparación con las células control (Fig.2A y B)., Al igual que en Calu-6, tras el tratamiento con H2O2, el número de células viables A549 disminuyó y las células muertas aumentaron significativamente de forma dosis-dependiente (Fig. 1C). Además, el H2O2 redujo de forma dosis dependiente el crecimiento de células A549 con una CI50 de ~100 µM (Fig. 1D). El tratamiento con 100 µMH2O2 también indujo significativamente un reposo de fase G1 en las células A549 en comparación con las células control (Fig. 2A y B).

H2O2 influences muerte por células y células de cáncer de pulmón tratadas con MMP (ΔΨm) inH2O2

posteriormente, se investigó más a fondo el papel de H2O2 en la muerte de células de cáncer de pulmón para obtener mayor comprensión., Mientras que 50-100 µM H2O2 aumentaron significativamente los porcentajes de células sub-G1 en células Calu-6, 250 µM H2O2 no aumentaron el porcentaje de células sub-G1 en estas células (Fig. 2A y C). Sin embargo, el tratamiento con 50–250 µM H2O2 aumentó de forma dosis dependiente los números de las células teñidas con anexina V-FITC en las células Calu-6 (Fig. 3A). Cuando el efecto de H2O2 sobre MMP (ΔΨm) en células Calu-6 fue evaluado usando rodamina 123, H2O2 provocó la pérdida de MMP (ΔΨm) en un escáner dosis-dependiente (Fig. 3B)., Con respecto al nivel de toMMP (ΔΨm) en las células Calu-6 excluyendo las células de tinción negativahodamina 123, H2O2 disminuyó el nivel de MMP (ΔΨm) en las células Calu-6 en un escáner dosis-dependiente (Fig. 3C). En las células A549, el tratamiento de 50 y 100 µM H2O2 aumentó significativamente los porcentajes de células sub-G1, pero el tratamiento con 250 y 500 µM H2O2 no mostró este efecto(Fig. 2A y C).H2O2 aumentó de forma dosis-dependiente el número de células A549 teñidas con annexina V-FITC (Fig.3D). Además, el H2O2, dependiente de la dosis, indujo la pérdida de MMP (ΔΨm) en las células A549 (Fig. 3E)., Mientras que 50 µMH2O2 aumentaron el nivel de MMP (ΔΨm) en las células A549, 100-250 µM H2O2 disminuyeron significativamente los niveles de MMP (ΔΨm) en estas células (Fig. 3F).

H2O2 influencesproteínas relacionadas con la apoptosis y caspasas células de cáncer de pulmón tratadas con inH2O2

la evaluación de las proteínas relacionadas con la apoptosis durante la muerte de células pulmonares inducida por 2O2 reveló que Bcl-2, una proteína antiapoptótica, disminuyó el tratamiento con uponH2O2 en células Calu-6 (Fig. 4A). El nivel de Pro-caspasa-3 se redujo en 75 µM H2O2 (Fig. 4A). La forma ininterrumpida de 116 kDa PARPwas no fue alterada por H2O2 (Fig. 4A)., La actividad de caspasa-3 aumentó en células Calu-6 tratadas con H2O2, mientras que la de caspasa-8 no se modificó significativamente(Fig. 4B). El tratamiento con 50-100 µMH2O2 pareció disminuir los niveles de Bcl-2,Pro-caspasa-3 y proteína PARP en las células A549 (Fig. 4C). Específicamente, 100 µMH2O2 mostraron una marcada disminución en los niveles de estas proteínas. El tratamiento con 75 µM H2O2 aumentó significativamente la actividad de caspasa-3 en las células A549 y aumentó significativamente la actividad de caspasa-8 (Fig. 4D).,

los inhibidores de la caspasa afectan el crecimiento celular y la muerte en células de cáncer pulmonar tratadas con H2O2

posteriormente se buscó descifrar el papel de las caspasas individuales en la muerte celular inducida por H2O2 a las 24 h en líneas celulares de carcinoma pulmonar. Las células Calu-6 y A549 fueron preincubadas con inhibidor de caspasa de 15 µM durante 1 h antes del tratamiento con 75 o 100 µM H2O2. Ninguno de los inhibidores de la caspasa probados influyó en la inhibición del crecimiento inducida por H2O2 en las líneas celulares Calu-6 y A549(Fig. 5A y D)., Sin embargo, todos los inhibidores de laaspasa probados en Calu-6 tratados con H2O2 disminuyeron los porcentajes de células sub-G1 hasta el nivel de las células control (Fig. 5B). Además, el tratamiento con todos los inhibidores de la caspasa probados redujo significativamente el número de células Calu-6 tratadas con inH2O2 teñidas de anexina V-FITC, pero el efecto decreciente fue más débil en comparación con la disminución de células sub-G1(Fig. 5C). Todos los inhibidores del caspo rescataron marcadamente las células A549 de la muerte celular promovida por H2O2, evaluada por la población de células sub-G1 (Fig.5E)., Además, estos inhibidores redujeron significativamente el número de células A549 tratadas con Inh2o2 teñidas con anexina V-FITC (Fig. 5F). Cada inhibidor de la caspasa tuvo efectos anti-muerte muy similares en las células de cáncer de pulmón tratadas con H2O2.

los inhibidores de la caspasa afectan a MMP(ΔΨm) en células de cáncer pulmonar tratadas con H2O2

la muerte celular está fuertemente asociada con el colapso de MMP (ΔΨm) (22).Así, se determinó MMP (ΔΨm) en 75 ó 100 µMH2O2 de células de cáncer de pulmón tratadas con o sin cada inhibidor de la caspasa a las 24 h., Sin embargo, todos los inhibidores de la Espasa no redujeron significativamente la pérdida de MMP(ΔΨm) en células Calu-6 tratadas con H2O2(Fig. 6A). Además, la mayoría de estos inhibidores no influyeron en el nivel MMP (ΔΨm) de las células Calu-6 tratadas con H2O2. Sin embargo, el inhibidor de la caspasa-9 (Z-LEHD) parece aumentar la disminución del nivel en estas células (Fig. 6B). en las células A549, todos los inhibidores de la caspasa previnieron parcialmente la pérdida de MMP (ΔΨm) por H2O2(Fig. 6C). Células A549 tratadas con InH2O2, el inhibidor de la caspasa-9 aumentó selectivamente la disminución del nivel de MMP (ΔΨm) (Fig. 6D)., Esta inhibitoralona redujo significativamente los niveles de MMP (ΔΨm) en las células de control Calu-6 y A549 (Fig. 6B y d).

discusión

el cáncer de pulmón representa una de las principales causas de mortalidad relacionada con el cáncer a nivel mundial y está relacionado con la actividad maliciosa de ROS. En el presente estudio, se utilizó exogenousH2O2 para generar estrés oxidativo en células de cáncer de pulmón. Este estudio se centró en definir los mecanismos moleculares de inhibición del crecimiento celular y muerte celular Calu-6 y células de cáncer de pulmón A549 tratadas con inH2O2., Sobre la base de los ensayos MTT, después de la exposición de 24 horas, los valores CI50 para H2O2 fueron ~50 y 100 µM en células Calu-6 y A549, respectivamente.H2O2 aumentó de forma dosis-dependiente el número de células Calu-6 y A549 teñidas con eritropoyetina V-FITC, indicando que la muerte de células de cáncer de pulmón inducida por H2O2 ocurrió a través de la apoptosis. Evidentemente, H2O2decreased los niveles de Bcl-2 y de Pro-caspase-3 en ambos tipos de la célula.PARP se redujo en las células A549 tratadas con H2O2. Además, las actividades de caspasa-3 y -8 se incrementaron en ambos tipos de células tratadas con H2O2.La Apoptosis está fuertemente relacionada con el colapso de MMP(ΔΨm) (22).,H2O2 desencadenó la pérdida de MMP (ΔΨm) en las células Calu-6 y A549 en un escáner dosis-dependiente, lo que indica que la muerte de las células de cáncer de pulmón por H2O2 estaba estrechamente relacionada con el colapso de MMP (ΔΨm). Además, H2O2decreased el nivel de MMP (ΔΨm) en células de cáncer de pulmón que contienen el colorante rhodamine 123.

aunque 50-100 µM H2O2 aumentaron significativamente los porcentajes de células sub-G1 Calu-6 y A549, 250 o 500 µM H2O2 no demostraron un efecto similar, lo que indica que las dosis más altas de H2O2 fijaron estas células de cáncer de pulmón de manera similar a etanol o metanol., Por lo tanto, H2O2 parecía inducir la muerte de las células de cáncer de pulmón simultáneamente a través de necrosis y apoptosis, dependiendo de su concentración. En particular, 75 y 100 µMH2O2 parecieron desencadenar simultáneamente apoptosis y necrosis en las células Calu-6, ya que estas dosis de H2O2 no aumentaron los porcentajes de células Sub-G1 en comparación con las células tratadas con H2O2 de 50 µM, así como tampoco hubo cambios en los niveles de la forma intact de la proteína PARP. Se requiere evaluar la actividad de la lactato deshidrogenasa extracelular en células de cáncer de pulmón tratadas con 50 – 500 µM H2O2 para la detección de la muerte celular necrótica., Estudios previos revelaron un papel del H2O2 en la detención de la fase del ciclo celular y la progresión mediante el ajuste de las proteínas relacionadas con el ciclo celular (23,24).en línea con esto, el tratamiento con 75 o 100 µMH2O2 entre las dosis probadas mostró significativamente una detención de la fase G1 en las células Calu-6 y A549. Por lo tanto, el arresto de la fase G1 junto con la inducción de la muerte celular es el mecanismo potencial detrás de la atenuación del crecimiento celular uponH2O2 tratamiento. Sin embargo, el H2O2 no produjo ninguna detención de fase específica del ciclo celular en las células HeLa (20)., Estos resultados indicaron que el estrés oxidativo inducido por 2O2 manifestaba sus efectos en la progresión del ciclo celular dependiendo del tipo de célula y la dosis de 2O2.

Los inhibidores de la caspasa utilizados en este experimento fallaron en atenuar la inhibición del crecimiento de las células cancerosas Calu-6 y A549 tratadas con inH2O2,mientras que estos inhibidores previnieron considerablemente la muerte celular inducida por H2O2 en estas células.Aunque H2O2 aumentó en cierta medida laactividad de caspasa-8 en ambas células de cáncer de pulmón, el inhibidor de caspasa-8 atenuó significativamente la muerte celular desencadenada por H2O2., Por lo tanto, una ligera alteración en la actividad de caspasa-8 pareció tener un fuerte impacto en la vía Pro-apoptótica en células de cáncer de pulmón tratadas con H2O2. Estos resultados también indicaron que ambas vías del receptor mitocondrial y de muerte celular se requerían mutuamente para la inducción total de apoptosis en células de cáncer de pulmón tratadas con H2O2. Sería importante determinar cómo H2O2 afecta la ruta del receptor de muerte celular para inducir la apoptosis en células de cáncer de pulmón. En cuanto a MMP (ΔΨm), los inhibidores de caspasa no tuvieron ningún efecto significativo en la pérdida de células Calu-6 y A549 tratadas con MMP (ΔΨm) inH2O2., Además, estos inhibidores no restablecieron los niveles disminuidos de MMP(ΔΨm) en las células de cáncer de pulmón tratadas con H2O2. En cambio, el inhibidor de la caspasa-9 aumentó los niveles decrecientes en estas células. Es plausible que la pérdida de mmmp (ΔΨm) después del tratamiento con H2O2 activó varias vías de receptores de muerte tomitocondrial y celular relacionadas con caspasas, induciendo consecuentemente la apoptosis, y la activación de caspasas por H2O2 no pudo mejorar positivamente la pérdida de MMP(ΔΨm)., Además, la pérdida de MMP(ΔΨm) inducida por H2O2 puede no ser suficiente para provocar completamente la apoptosis en las células Calu-6 y A549 bajo la regulación a la baja de la actividad de la caspasa.

en conclusión, el H2O2 inhibió el crecimiento de las células de cáncer de pulmón a través de la muerte celular y la fase G1 en reposo del ciclo celular. La muerte celular Calu-6 y A549 causada por H2O2 resultó de necrosis, así como de apoptosis dependiente de ascaspasa (Fig.7). Los resultados actuales proporcionan información útil para comprender el efecto citotoxicológico del exogenousH2O2 sobre las células de cáncer de pulmón en lo que respecta al crecimiento y la muerte de las células., Además, nuevas estrategias para el tratamiento del cáncer de pulmón basadas en el uso de H2O2 pueden ser útiles en la reducción de la mortalidad relacionada con esta alineación.

Agradecimientos

No aplicable.

financiación

El presente estudio fue apoyado por una subvención de la Fundación Nacional de Investigación De Corea (NRF) financiada por el gobierno coreano (MSIP; 2016R1A2B4007773) y apoyada por el ‘programa de apoyo al fondo de construcción de ResearchBase’ financiado por la Universidad Nacional de Chonbuk en 2018.,

disponibilidad de datos y materiales

todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado.

contribuciones de los autores

WHP fue el único contribuyente a la concepción y diseño, adquisición de datos, análisis e interpretación de datos y redacción del manuscrito. WHP es responsable de todos los aspectos del trabajo para garantizar que las cuestiones relacionadas con la exactitud o integridad de cualquier parte del trabajo se investigan y resuelven adecuadamente.

aprobación ética y consentimiento para participar

No aplicable.,

consentimiento del paciente para la publicación

No aplicable.

intereses en competencia

El autor declara que no tiene intereses en competencia.,-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide

FITC

fluorescein isothiocyanate

PI

propidium iodide

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