Microbiología

una mutación es un cambio heredable en la secuencia de ADN de un organismo., El organismo resultante, llamado mutante, puede tener un cambio reconocible en el fenotipo en comparación con el tipo salvaje, que es el fenotipo más comúnmente observado en la naturaleza. Un cambio en la secuencia de ADN se confiere al ARNm a través de la transcripción, y puede conducir a una secuencia alterada de aminoácidos en una proteína en la traducción. Debido a que las proteínas llevan a cabo la gran mayoría de las funciones celulares, un cambio en la secuencia de aminoácidos en una proteína puede conducir a un fenotipo alterado para la célula y el organismo.,

efectos de las mutaciones en la secuencia de ADN

Hay varios tipos de mutaciones que se clasifican de acuerdo con cómo se altera la molécula de ADN. Un tipo, llamado mutación puntual, afecta a una sola base y ocurre más comúnmente cuando una base es sustituida o reemplazada por otra. Las mutaciones también resultan de la adición de una o más bases, conocidas como inserción, o la eliminación de una o más bases, conocidas como deleción.

efectos de las mutaciones en la estructura y función de las proteínas

Las mutaciones puntuales pueden tener una amplia gama de efectos en la función de las proteínas (Figura 1). Como consecuencia de la degeneración del código genético, una mutación puntual comúnmente resultará en que el mismo aminoácido se incorpore al polipéptido resultante a pesar del cambio de secuencia. Este cambio no tendría ningún efecto en la estructura de la proteína, y por lo tanto se llama una mutación silenciosa. Una mutación missense resulta en un aminoácido diferente que se incorpora en el polipéptido resultante., El efecto de una mutación sin sentido depende de cuán químicamente diferente es el nuevo aminoácido del aminoácido de tipo salvaje. La ubicación del aminoácido cambiado dentro de la proteína también es importante. Por ejemplo, si el aminoácido modificado es parte del sitio activo de la enzima, entonces el efecto de la mutación missense puede ser significativo. Muchas mutaciones sin sentido resultan en proteínas que todavía son funcionales, al menos hasta cierto punto. A veces, los efectos de las mutaciones sin sentido solo pueden ser evidentes bajo ciertas condiciones ambientales; tales mutaciones sin sentido se llaman mutaciones condicionales., En raras ocasiones, una mutación sin sentido puede ser beneficiosa. Bajo las condiciones ambientales adecuadas, este tipo de mutación puede dar al organismo que la alberga una ventaja selectiva. Sin embargo, otro tipo de mutación puntual, llamada mutación sin sentido, convierte un codón que codifica un aminoácido (un codón de sentido) en un codón de parada (un codón sin sentido). Las mutaciones sin sentido resultan en la síntesis de proteínas que son más cortas que el tipo salvaje y típicamente no funcionales.

las eliminaciones e inserciones también causan varios efectos., Debido a que los codones son trillizos de nucleótidos, las inserciones o deleciones en grupos de tres nucleótidos pueden conducir a la inserción o deleción de uno o más aminoácidos y pueden no causar efectos significativos en la funcionalidad de la proteína resultante. Sin embargo, las mutaciones de cambio de Marco, causadas por inserciones o eliminaciones de un número de nucleótidos que no son un múltiplo de tres, son extremadamente problemáticas debido a un cambio en los resultados del marco de lectura (Figura 1). Debido a que los ribosomas leen el ARNm en los codones triples, las mutaciones de cambio de Marco pueden cambiar cada aminoácido después del punto de la mutación., El nuevo marco de lectura también puede incluir un codón de parada antes del final de la secuencia de codificación. En consecuencia, las proteínas hechas de genes que contienen mutaciones de cambio de marco son casi siempre no funcionales.

la Figura 1. Haga clic para ampliar la imagen. Las mutaciones pueden conducir a cambios en la secuencia proteica codificada por el ADN.

una mutación beneficiosa

desde que se reportó el primer caso de infección por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) en 1981, casi 40 millones de personas han muerto a causa de la infección por el VIH, el virus que causa el síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA)., El virus se dirige a las células T auxiliares que desempeñan un papel clave en la reducción de la respuesta inmune innata y adaptativa, infectando y matando a las células que normalmente participan en la respuesta del cuerpo a la infección. No hay cura para la infección por el VIH, pero se han desarrollado muchos medicamentos para retrasar o bloquear la progresión del virus. Aunque las personas en todo el mundo pueden estar infectadas, la prevalencia más alta entre las personas de 15 a 49 años de edad se encuentra en el África subsahariana, donde casi una persona de cada 20 está infectada, lo que representa más del 70% de las infecciones en todo el mundo (Figura 2)., Desafortunadamente, esta es también una parte del mundo donde las estrategias de prevención y los medicamentos para tratar la infección son los más deficientes.

la Figura 2. El VIH es muy prevalente en el África subsahariana, pero su prevalencia es bastante baja en otras partes del mundo.

en los últimos años, el interés científico ha sido despertado por el descubrimiento de unos pocos individuos del norte de Europa que son resistentes a la infección por VIH. En 1998, el genetista estadounidense Stephen J., O’Brien de los Institutos Nacionales de salud (NIH) y sus colegas publicaron los resultados de su análisis genético de más de 4,000 individuos. Estos indicaron que muchos individuos de ascendencia Euroasiática (hasta el 14% en algunos grupos étnicos) tienen una mutación de deleción, llamada CCR5-delta 32, en el gen que codifica CCR5. CCR5 es un coreceptor que se encuentra en la superficie de las células T y que es necesario para que muchas cepas del virus entren en la célula huésped. La mutación conduce a la producción de un receptor al que el VIH no puede unirse eficazmente y, por lo tanto, bloquea la entrada viral., Las personas homocigotas para esta mutación han reducido en gran medida la susceptibilidad a la infección por el VIH, y aquellos que son heterocigotas tienen cierta protección contra la infección también.

no está claro por qué las personas de ascendencia del Norte de Europa, específicamente, portan esta mutación, pero su prevalencia parece ser más alta en el norte de Europa y disminuye constantemente en las poblaciones a medida que se mueve hacia el sur. La investigación indica que la mutación ha estado presente desde antes de que apareciera el VIH y puede haber sido seleccionada en poblaciones europeas como resultado de la exposición a la peste o la viruela., Esta mutación puede proteger a los individuos de la peste (causada por la bacteria Yersinia pestis) y la viruela (causada por el virus variola) porque este receptor también puede estar involucrado en estas enfermedades. La edad de esta mutación es un tema de debate, pero las estimaciones sugieren que apareció entre 1875 y 225 años atrás, y puede haberse propagado desde el norte de Europa a través de invasiones vikingas.

este emocionante hallazgo ha llevado a nuevas vías en la investigación del VIH, incluida la búsqueda de medicamentos para bloquear la Unión del CCR5 al VIH en individuos que carecen de la mutación., Aunque es posible realizar pruebas de ADN para determinar qué individuos portan la mutación CCR5-delta 32, hay casos documentados de individuos homocigotos para la mutación que contraen el VIH. Por esta razón, las pruebas de ADN para la mutación no son ampliamente recomendadas por los funcionarios de salud pública para no alentar un comportamiento de riesgo en aquellos que portan la mutación. Sin embargo, la inhibición de la Unión del VIH al CCR5 sigue siendo una estrategia válida para el desarrollo de terapias farmacológicas para las personas infectadas por el VIH.,

causas de mutaciones

Los errores en el proceso de replicación del ADN pueden causar mutaciones espontáneas. La tasa de error de la ADN polimerasa es una base incorrecta por mil millones de pares de bases replicadas. La exposición a mutágenos puede causar mutaciones inducidas, que son varios tipos de agentes químicos o radiación (Tabla 1). La exposición a un mutágeno puede aumentar la tasa de mutación más de 1000 veces. Los mutágenos a menudo también son carcinógenos, agentes que causan cáncer. Sin embargo, mientras que casi todos los carcinógenos son mutagénicos, no todos los mutágenos son necesariamente carcinógenos.,

mutágenos químicos

varios tipos de mutágenos químicos interactúan directamente con el ADN, ya sea actuando como análogos de nucleósidos o modificando las bases de nucleótidos., Las sustancias químicas llamadas análogos de nucleósidos son estructuralmente similares a las bases normales de nucleótidos y pueden incorporarse al ADN durante la replicación (Figura 3). Estos análogos de base inducen mutaciones porque a menudo tienen reglas de emparejamiento de bases diferentes a las bases que reemplazan. Otros mutágenos químicos pueden modificar las bases normales del ADN, lo que resulta en diferentes reglas de emparejamiento de bases. Por ejemplo, el ácido nitroso desamina la citosina, convirtiéndola en uracilo. El uracilo luego se empareja con la adenina en una ronda posterior de replicación, lo que resulta en la conversión de un par de bases GC a un par de bases AT., El ácido nitroso también desamina la adenina a hipoxantina, cuya base se empareja con la citosina en lugar de la timina, lo que resulta en la conversión de un par de bases TA a un par de bases CG.

la Figura 3. Haga clic para ampliar la imagen. (a) el nucleósido de 2-aminopurina (2AP) estructuralmente es un análogo del nucleósido de adenina, mientras que el 5-bromouracilo (5BU) es un análogo del nucleósido de timina. 2AP pares de base con C, convirtiendo un par de base AT a un par de base GC después de varias rondas de replicación., 5BU se empareja con G, convirtiendo un par de base AT en un par de base GC después de varias rondas de replicación. (B) El ácido nitroso es un tipo diferente de mutágeno químico que modifica las bases nucleósidas ya existentes como C para producir U, que se empareja con A. Esta modificación química, como se muestra aquí, resulta en la conversión de un par de bases CG a un par de bases TA.

Los mutágenos químicos conocidos como agentes intercalantes funcionan de manera diferente., Estas moléculas se deslizan entre las bases nitrogenadas apiladas de la doble hélice del ADN, distorsionando la molécula y creando un espaciamiento atípico entre pares de bases de nucleótidos (Figura 4). Como resultado, durante la replicación del ADN, la ADN polimerasa puede omitir la replicación de varios nucleótidos (creando una deleción) o insertar nucleótidos adicionales (creando una inserción). Cualquiera de los resultados puede llevar a una mutación de cambio de Marco. Los productos de combustión como los hidrocarburos aromáticos policíclicos son agentes intercalantes particularmente peligrosos que pueden conducir a cánceres causados por mutaciones., Los agentes intercalantes bromuro de etidio y naranja de acridina se utilizan comúnmente en el laboratorio para teñir el ADN para la visualización y son mutágenos potenciales.

la Figura 4. Los agentes intercalantes, como la acridina, introducen un espaciamiento atípico entre pares de bases, lo que resulta en una polimerasa de ADN que introduce una deleción o una inserción, lo que conduce a una mutación potencial de cambio de Marco.

radiación

la exposición a radiación ionizante o no ionizante puede inducir mutaciones en el ADN, aunque por diferentes mecanismos., La radiación ionizante fuerte, como los rayos X y los rayos gamma, puede causar roturas de cadena simple y doble en la columna vertebral del ADN a través de la formación de radicales hidroxilo en la exposición a la radiación (Figura 5). La radiación ionizante también puede modificar las bases; por ejemplo, la desaminación de la citosina a uracilo, análoga a la acción del ácido nitroso. La exposición a la radiación ionizante se usa para matar microbios para esterilizar dispositivos médicos y alimentos, debido a su dramático efecto inespecífico en dañar el ADN, las proteínas y otros componentes celulares (véase usar métodos físicos para controlar microorganismos).,

la radiación no ionizante, como la luz ultravioleta, no es lo suficientemente energética para iniciar este tipo de cambios químicos. Sin embargo, la radiación no ionizante puede inducir la formación de dímeros entre dos bases pirimidínicas adyacentes, comúnmente dos timinos, dentro de una hebra de nucleótidos. Durante la formación del dímero de timina, las dos timinas adyacentes se unen covalentemente y, si se dejan sin reparar, tanto la replicación del ADN como la transcripción se estancan en este punto. La polimerasa de ADN puede proceder y replicar el dímero incorrectamente, lo que potencialmente conduce a mutaciones puntuales o de cambio de Marco.,

la Figura 5. a) la radiación ionizante puede dar lugar a la formación de roturas monocatenarias y bicatenarias en la columna vertebral de azúcar-fosfato del ADN, así como a la modificación de las bases (no se muestra). b) la radiación no ionizante, como la luz ultravioleta, puede dar lugar a la formación de dímeros de timina, que pueden detener la replicación y la transcripción e introducir mutaciones puntuales o de desplazamiento del marco.

reparación del ADN

el proceso de replicación del ADN es altamente preciso, pero los errores pueden ocurrir espontáneamente o ser inducidos por mutágenos. Errores no corregidos pueden llevar a graves consecuencias para el fenotipo. Las células han desarrollado varios mecanismos de reparación para minimizar el número de mutaciones que persisten.,

corrección

La mayoría de los errores introducidos durante la replicación del ADN son corregidos rápidamente por la mayoría de las polimerasas de ADN a través de una función llamada corrección. En la revisión, la polimerasa de ADN lee la base recién agregada, asegurando que sea complementaria a la base correspondiente en la hebra de la plantilla Antes de agregar la siguiente. Si se ha agregado una base incorrecta, la enzima hace un corte para liberar el nucleótido incorrecto y se agrega una nueva base.,

reparación de desajustes

algunos errores introducidos durante la replicación se corrigen poco después de que la maquinaria de replicación se haya movido. Este mecanismo se llama reparación de desajustes. Las enzimas involucradas en este mecanismo reconocen el nucleótido agregado incorrectamente, lo extirpan y lo reemplazan con la base correcta. Un ejemplo es la reparación del desajuste dirigido a metilo en E. coli. El ADN está hemimetilado. Esto significa que el filamento parental está metilado mientras que el filamento hija recién sintetizado no lo está. Toma varios minutos antes de que la nueva hebra sea metilada., Las proteínas MutS, MutL y MutH se unen al sitio hemimetilado donde se encuentra el nucleótido incorrecto. MutH corta la hebra no metilada (la nueva hebra). Una exonucleasa elimina una porción de la hebra (incluyendo el nucleótido incorrecto). El espacio formado es entonces llenado por ADN pol III y ligasa.

reparación de dímeros de timina

debido a que la producción de dímeros de timina es común (muchos organismos no pueden evitar la luz ultravioleta), se han desarrollado mecanismos para reparar estas lesiones., En la reparación por escisión de nucleótidos (también llamada reparación oscura), las enzimas eliminan el dímero de pirimidina y lo reemplazan con los nucleótidos correctos (Figura 6). En E. coli, el ADN es escaneado por un complejo enzimático. Si se encuentra una distorsión en la doble hélice que fue introducida por el dímero de pirimidina, el complejo enzimático corta la columna vertebral de azúcar-fosfato varias bases aguas arriba y aguas abajo del dímero, y el segmento de ADN entre estos dos cortes se elimina enzimáticamente. El ADN pol I reemplaza los nucleótidos faltantes con los correctos y la ADN ligasa sella el espacio en la columna vertebral de azúcar-fosfato.,

la reparación directa (también llamada reparación de luz) de los dímeros de timina se produce a través del proceso de fotorreactivación en presencia de luz visible. Una enzima llamada fotoliasa reconoce la distorsión en la hélice del ADN causada por el dímero de timina y se une al dímero. Luego, en presencia de luz visible, la enzima fotoliasa cambia la conformación y rompe el dímero de timina, permitiendo que las thymines se emparejen de nuevo correctamente con las adeninas en la hebra complementaria., La fotorreactivación parece estar presente en todos los organismos, a excepción de los mamíferos placentarios, incluidos los seres humanos. La fotorreactivación es particularmente importante para los organismos expuestos crónicamente a la radiación ultravioleta, como las plantas, las bacterias fotosintéticas, las algas y los corales, para evitar la acumulación de mutaciones causadas por la formación de dímeros de timina.

la Figura 6. Haga clic para ampliar la imagen. Las bacterias tienen dos mecanismos para reparar los dímeros de timina., (a) en la reparación por escisión de nucleótidos, un complejo enzimático reconoce la distorsión en el complejo de ADN alrededor del dímero de timina y corta y elimina la cadena de ADN dañada. Los nucleótidos correctos son reemplazados por ADN pol I y la hebra de nucleótido es sellada por ADN ligasa. b) en la fotorreactivación, la enzima fotoliasa se une al dímero de timina y, en presencia de luz visible, rompe el dímero, restaurando el emparejamiento de la base de las thymines con adeninas complementarias en la cadena de ADN opuesta.,

identificación de mutantes bacterianos

Una técnica común utilizada para identificar mutantes bacterianos se llama recubrimiento de réplica., Esta técnica se utiliza para detectar mutantes nutricionales, llamados auxotrofos, que tienen una mutación en un gen que codifica una enzima en la vía de biosíntesis de un nutriente específico, como un aminoácido. Como resultado, mientras que las células de tipo silvestre conservan la capacidad de crecer normalmente en un medio que carece del nutriente específico, los auxótrofos no pueden crecer en dicho medio. Durante la reproducción de placas (Figura 7), una población de células bacterianas se mutageniza y luego se platea como células individuales en una placa compleja nutricionalmente completa y se permite que crezcan en colonias., Las células de estas colonias se retiran de esta placa maestra, a menudo utilizando terciopelo estéril. Este terciopelo, que contiene células, se presiona en la misma orientación sobre placas de varios medios. Al menos una placa también debe estar completa nutricionalmente para garantizar que las células se transfieran correctamente entre las placas. Las otras placas carecen de nutrientes específicos, lo que permite al investigador descubrir varios mutantes auxotróficos incapaces de producir nutrientes específicos. Las células de la colonia correspondiente en la placa nutricionalmente completa se pueden utilizar para recuperar el mutante para un estudio posterior.,

la Figura 7. La identificación de mutantes auxotróficos, como los auxotróficos de histidina, se realiza utilizando placas de réplica. Después de la MUTAGÉNESIS, las colonias que crecen en medio nutricionalmente completo pero no en medio que carece de histidina se identifican como auxotrofos de histidina.

la prueba de Ames

la prueba de Ames, desarrollada por Bruce Ames (1928–) en la década de 1970, es un método que utiliza bacterias para la detección rápida y económica del potencial carcinogénico de nuevos compuestos químicos. La prueba mide la tasa de mutación asociada con la exposición al compuesto, que, si es elevada, puede indicar que la exposición a este compuesto está asociada con un mayor riesgo de cáncer., La prueba de Ames utiliza como organismo de prueba una cepa de Salmonella typhimurium que es un auxótrofo de histidina, incapaz de sintetizar su propia histidina debido a una mutación en un gen esencial requerido para su síntesis. Después de la exposición a un potencial mutágeno, estas bacterias se platean en un medio que carece de histidina, y el número de mutantes que recuperan la capacidad de sintetizar histidina se registra y se compara con el número de tales mutantes que surgen en ausencia del potencial mutágeno (Figura 8)., Los productos químicos que son más mutagénicos producirán más mutantes con la síntesis de histidina restaurada en la prueba de Ames. Debido a que muchos productos químicos no son directamente mutagénicos, sino que son metabolizados a formas mutagénicas por las enzimas hepáticas, el extracto de hígado de rata se incluye comúnmente al comienzo de este experimento para imitar el metabolismo hepático. Una vez realizada la prueba de Ames, los compuestos identificados como mutagénicos se someten a pruebas adicionales para determinar sus posibles propiedades cancerígenas utilizando otros modelos, incluidos modelos animales como ratones y ratas.

la Figura 8., La prueba de Ames se utiliza para identificar sustancias químicas mutagénicas, potencialmente cancerígenas. Se utiliza un auxótrofo de Salmonella histidina como cepa de prueba, expuesta a un potencial mutágeno / carcinógeno. El número de mutantes de reversión capaces de crecer en ausencia de histidina suministrada se cuenta y se compara con el número de mutantes de reversión naturales que surgen en ausencia del mutágeno potencial.