la técnica básica para la detección de RFLPs consiste en fragmentar una muestra de ADN con la aplicación de una enzima de restricción, que puede escindir selectivamente una molécula de ADN donde se reconoce una secuencia corta y específica en un proceso conocido como digestión de restricción. Los fragmentos de ADN producidos por el digerido se separan por longitud a través de un proceso conocido como electroforesis en gel de agarosa y se transfieren a una membrana a través del procedimiento Southern blot., La hibridación de la membrana a una sonda de ADN etiquetada determina la longitud de los fragmentos que son complementarios a la sonda. Se dice que un polimorfismo de longitud de fragmento de restricción ocurre cuando la longitud de un fragmento detectado varía entre individuos, indicando homologías de secuencia no idénticas. Cada longitud de fragmento se considera un alelo, ya sea que en realidad contenga una región codificante o no, y se puede usar en el análisis genético posterior.,
esquema de RFLP por el sitio de clivaje de la pérdida
Análisis y la herencia de los alelos de RFLP de los fragmentos (NIH)
esquema de RFLP por VNTR variación de la longitud de
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Existen dos mecanismos por los cuales el tamaño de un determinado fragmento de restricción puede variar. En el primer esquema, un pequeño segmento del genoma está siendo detectado por una sonda de ADN (línea más gruesa)., En el alelo A, el genoma es escindido por una enzima de restricción en tres sitios cercanos (triángulos), pero solo el fragmento más a la derecha será detectado por la sonda. En el alelo a, el sitio de restricción 2 se ha perdido por una mutación, por lo que la sonda ahora detecta el fragmento fusionado más grande que se extiende desde los sitios 1 a 3. El segundo diagrama muestra cómo se vería esta variación del tamaño del fragmento en una mancha Sur, y cómo cada alelo (dos por individuo) podría heredarse en los miembros de una familia.,
en el tercer esquema, la sonda y la enzima de restricción se eligen para detectar una región del genoma que incluye un segmento de repetición en tándem de número variable (VNTR) (cajas en el diagrama esquemático). En el alelo c, hay cinco repeticiones en el VNTR, y la sonda detecta un fragmento más largo entre los dos sitios de restricción. En el alelo d, solo hay dos repeticiones en el VNTR, por lo que la sonda detecta un fragmento más corto entre los mismos dos sitios de restricción. Otros procesos genéticos, como inserciones, deleciones, translocaciones e Inversiones, también pueden conducir a polimorfismos., Las pruebas RFLP requieren muestras mucho más grandes de ADN que las pruebas de repetición corta en tándem (STR).