el desarrollo, la diferenciación y el crecimiento de células y tejidos requieren patrones de expresión génica regulados con precisión. Los potenciadores funcionan como elementos cis-reguladores para mediar el control espacial y temporal del desarrollo activando la transcripción en células específicas y/o reprimiéndola en otras células. Por lo tanto, la combinación particular de factores de transcripción y otras proteínas de unión al ADN en un tejido en desarrollo controla qué genes se expresarán en ese tejido. Los potenciadores permiten que el mismo gen se utilice en diversos procesos en el espacio y el tiempo.,
Identificación y caracterizacióneditar
tradicionalmente, los potenciadores se identificaban mediante técnicas de Trampa de potenciadores utilizando un gen reportero o mediante análisis comparativo de secuencias y genómica computacional. En modelos genéticamente manejables como la mosca de la fruta Drosophila melanogaster, por ejemplo, un constructo reportero como el gen lacZ puede ser integrado aleatoriamente en el genoma usando un transposón del elemento P. Si el gen reportero se integra cerca de un potenciador, su expresión reflejará el patrón de expresión impulsado por ese potenciador., Por lo tanto, la tinción de las moscas para la expresión o actividad de LacZ y la clonación de la secuencia que rodea el sitio de integración permite la identificación de la secuencia de potenciador.
el desarrollo de tecnologías genómicas y epigenómicas, sin embargo, ha cambiado drásticamente la perspectiva para el descubrimiento de Módulos cis-regulatorios (CRM)., Los métodos de secuenciación de próxima generación (NGS) ahora permiten ensayos de descubrimiento de CRM funcionales de alto rendimiento, y las cantidades enormemente crecientes de datos disponibles, incluidas bibliotecas a gran escala de motivos de sitios de enlace de factores de transcripción (TFBS), colecciones de CRM anotados y validados y datos epigenéticos extensos en muchos tipos de células, están haciendo que el descubrimiento de CRM computacional preciso sea un objetivo alcanzable. Un ejemplo de enfoque basado en NGS llamado DNase-seq ha permitido la identificación de nucleosomas agotados, o regiones abiertas de cromatina, que pueden contener CRM., Más recientemente se han desarrollado técnicas como ATAC-seq que requieren menos material de partida. Las regiones agotadas de los nucelosomas se pueden identificar in vivo a través de la expresión de la metilasa Dam, lo que permite un mayor control de la identificación de potenciadores específicos de tipo celular.Los métodos computacionales incluyen genómica comparativa, agrupación de sitios de unión de TF conocidos o predichos, y enfoques de aprendizaje automático supervisados entrenados en CRM conocidos., Todos estos métodos han demostrado ser eficaces para el descubrimiento de CRM, pero cada uno tiene sus propias consideraciones y limitaciones, y cada uno está sujeto a un mayor o menor número de falsos positivos identifications.In el enfoque de genómica comparativa, la conservación de secuencias de regiones no codificantes puede ser indicativo de potenciadores. Las secuencias de múltiples especies están alineadas, y las regiones conservadas se identifican computacionalmente., Las secuencias identificadas se pueden unir a un gen reportero como la proteína fluorescente verde o lacZ para determinar el patrón in vivo de expresión génica producido por el potenciador cuando se inyecta en un embrión. la expresión de ARNm del reportero puede ser visualizada por hibridación in situ, que proporciona una medida más directa de la actividad potenciadora, ya que no está sujeta a las complejidades de la traducción y el plegamiento de proteínas., Aunque mucha evidencia ha señalado la conservación de secuencias para potenciadores críticos del desarrollo, otros trabajos han demostrado que la función de los potenciadores se puede conservar con poca o ninguna conservación de secuencias primarias. Por ejemplo, los Potenciadores de RET en humanos tienen muy poca conservación de secuencias a las del pez cebra, sin embargo, las secuencias de ambas especies producen patrones casi idénticos de expresión génica reportera en el pez cebra., De manera similar, en insectos altamente divergentes (separados por alrededor de 350 millones de años), se encontró que patrones similares de expresión génica de varios genes clave estaban regulados a través de CRM de constitución similar, aunque estos CRM no muestran ninguna conservación apreciable de la secuencia detectable por métodos estándar de alineación de secuencias como BLAST.
en la segmentación de insectsEdit
Los potenciadores que determinan la segmentación temprana en embriones de Drosophila melanogaster se encuentran entre los mejor caracterizados potenciadores del desarrollo., En el embrión de la mosca temprana, los factores de transcripción del gen gap son responsables de activar y reprimir una serie de genes de segmentación, como los genes de regla de par. Los genes gap se expresan en bloques a lo largo del eje anterior-posterior de la mosca junto con otros factores de transcripción de efecto materno, creando así zonas dentro de las cuales se expresan diferentes combinaciones de factores de transcripción. Los genes de la regla del par están separados unos de otros por células que no se expresan. Por otra parte, las rayas de expresión para diferentes genes de regla de par se compensan por unos pocos diámetros celulares entre sí., Por lo tanto, las combinaciones únicas de expresión génica de regla de par crean dominios espaciales a lo largo del eje anterior-posterior para configurar cada uno de los 14 segmentos individuales. El potenciador de 480 bp responsable de conducir la banda afilada dos del gen par-regla incluso saltado (eve) ha sido bien caracterizado. El potenciador contiene 12 sitios de unión diferentes para los factores de transcripción de genes maternos y gap. Activando y reprimiendo sitios se superponen en secuencia., Eve solo se expresa en una franja estrecha de células que contienen altas concentraciones de los activadores y baja concentración de los represores para esta secuencia potenciadora. Otras regiones potenciadoras impulsan la expresión de eve en otras 6 rayas en el embrión.
en el modelado de vertebradoseditar
establecer ejes corporales es un paso crítico en el desarrollo animal. Durante el desarrollo embrionario del ratón, Nodal, un ligando de la superfamilia del factor de crecimiento beta transformador, es un gen clave involucrado en el patrón tanto del eje anterior-posterior como del eje izquierdo-derecho del embrión temprano., El gen Nodal contiene dos potenciadores: el potenciador de Epiblastos Proximal (PEE) y el potenciador asimétrico (ASE). La orina está aguas arriba del gen Nodal y conduce la expresión Nodal en la porción de la racha primitiva que se diferenciará en el nodo (también conocido como el nodo primitivo). La orina activa la expresión ganglionar en respuesta a una combinación de señalización Wnt más una segunda señal desconocida; por lo tanto, un miembro de la familia de factores de transcripción LEF/TCF probablemente se une a un sitio de unión TCF en las células del nodo., La difusión del nódulo lejos del nodo forma un gradiente que luego modela el eje anterior-posterior que se extiende del embrión. El ASE es un potenciador intrónico Unido por el factor de transcripción de dominio de cabeza de horquilla Fox1. Al principio del desarrollo, la expresión Nodal impulsada por Fox1 establece el endodermo visceral. Más adelante en el desarrollo, la Unión de Fox1 al ASE impulsa la expresión Nodal en el lado izquierdo del mesodermo de la placa lateral, estableciendo así la asimetría izquierda-derecha necesaria para el desarrollo asimétrico de órganos en el mesodermo.,
establecer tres capas germinales durante la gastrulación es otro paso crítico en el desarrollo animal. Cada una de las tres capas germinales tiene patrones únicos de expresión génica que promueven su diferenciación y desarrollo. El endodermo se especifica temprano en el desarrollo por la expresión de Gata4, y Gata4 pasa a dirigir la morfogénesis intestinal más tarde. La expresión de Gata4 es controlada en el embrión temprano por un potenciador intrónico que se une a otro factor de transcripción de dominio forkhead, FoxA2., Inicialmente, el potenciador impulsa una amplia expresión génica en todo el embrión, pero la expresión se restringe rápidamente al endodermo, lo que sugiere que otros represores pueden estar involucrados en su restricción. Al final del desarrollo, el mismo potenciador restringe la expresión a los tejidos que se convertirán en el estómago y el páncreas. Un potenciador adicional es responsable de mantener la expresión de Gata4 en el endodermo durante las etapas intermedias del desarrollo intestinal.,
potenciadores múltiples promueven la robustez del desarrolloEditar
algunos genes involucrados en procesos críticos del desarrollo contienen potenciadores múltiples de la función superpuesta. Los potenciadores secundarios, o» potenciadores de la sombra», se pueden encontrar muchas kilobases lejos del potenciador primario («primario» generalmente se refiere al primer potenciador descubierto, que a menudo está más cerca del gen que regula). Por sí solo, cada potenciador impulsa Patrones casi idénticos de expresión génica. ¿Los dos potenciadores son realmente redundantes?, Trabajos recientes han demostrado que múltiples potenciadores permiten a las moscas de la fruta sobrevivir a perturbaciones ambientales, como un aumento de la temperatura. Cuando se eleva a una temperatura elevada, un solo potenciador a veces no logra impulsar el patrón completo de expresión, mientras que la presencia de ambos potenciadores permite la expresión génica normal.