efectos de los agentes mutagénicos en la secuencia de ADN en plantas
antecedentes:
los fitomejoradores y agricultores modernos pueden explotar una riqueza de biodiversidad natural, que puede ampliarse ampliamente mediante la aplicación de técnicas de inducción de mutaciones., El impacto de la mutación inducida en la mejora de los cultivos se refleja en las 2316 variedades oficialmente registradas (base de datos del OIEA sobre variedades mutantes oficialmente registradas, MVD) que portan nuevas variaciones inducidas. Además, alrededor de tres cuartas partes de estas son variedades mutantes directas derivadas del tratamiento con rayos gamma, lo que resalta la importancia de los mutágenos físicos. Todo esto se traduce en un tremendo impacto económico en la agricultura y la producción de alimentos que actualmente se valora en miles de millones de dólares y millones de hectáreas cultivadas (Ahloowalia et al. en prep.)., Sin embargo, aunque el potencial agronómico de la mutación inducida es bien entendido, los efectos precisos de diferentes mutagenicagentes en la secuencia de ADN en las plantas nunca se han descrito. Además, en los últimos años, la genética inversa novedosa y las tecnologías de descubrimiento de genes han estimulado un interés renovado en la mutación inducida. Para estas nuevas aplicaciones es necesario entender más claramente los tipos de mutaciones generadas por las diferentes clases de mutágenos, y medir su frecuencia y distribución a lo largo del genoma., Hoy en día, y por primera vez, las tecnologías están en su lugar para llevar a cabo los experimentos necesarios para obtener esta comprensión.
Los agentes mutagénicos pueden clasificarse en tres categorías: físicos (por ejemplo, rayos gamma), químicos (por ejemplo, etilsulfonato de metano) y elementos transponibles (como transposones,retrotransposones, ADN-T, Retrovirus). En la actualidad, se dispone de Datos limitados sobre el alcance de los efectos genéticos inducidos a nivel molecular en las plantas y sobre la especificidad y la eficacia relativa de estas diferentes categorías de agentes., Estos efectos involucran daño al ADN, lo que resulta en cambios en el par de bases (polimorfismos de nucleótidos simples/simples, SNPs),pequeñas inserciones y deleciones (indels) y reordenamientos cromosómicos. Aún menos se sabe sobre cómo la mutación inducida interactúa con los procesos epigenéticos, como la metilación,la activación de retroelementos y la perturbación de la estructura del ADN de orden superior.,
mientras que los criadores han estado utilizando la inducción de mutaciones para ampliar la base genética del germoplasma, y han utilizado las líneas mutantes directamente como nuevas variedades o como fuentes de Nueva variaciónen programas de cruzamiento, el conocimiento de la naturaleza precisa de las mutaciones inducidas no era necesario. Intuitivamente, se consideró ideal un nivel conservador de reordenamiento y eliminación de pares de bases pequeños. Hoy en día, el uso de técnicas de mutación se ha expandido más allá de las aplicaciones en la cría para el descubrimiento de genes y la genética inversa., Estas nuevas aplicaciones de alto rendimiento requieren clases específicas de mutaciones que se inducen con alta eficiencia en genomas de plantas de cultivos enteros, y en consecuencia el conocimiento de la naturaleza precisa de la mutación inducida se está convirtiendo en un problema.
los métodos de descubrimiento de genes de alto rendimiento dependen en gran medida de las líneas ‘knockout’ de inserción, Las ahora clásicas ‘máquinas de genes’ y las bibliotecas ‘knockout’ de eliminación. La mutagenesia insercional implica inducir una mayor actividad de transposición de elementos transponibles conocidos (p. ej., retrotransposones que tienden a transponerse en genes activos) para producir series de linesina que, en teoría, cada gen en el genoma habrá sido inactivado por la inserción de transposones. Estas líneas se pueden utilizar para identificar genes que causan fenotipos particulares o, por el contrario, se pueden utilizar para identificar la función del gen mediante la búsqueda de un fenotipo asociado con la inactivación de un gen conocido en particular. Sin embargo, los mutantes insercionales tienen tendencia a ser inestables (es decir, escisión de la etiqueta de transposón, p. ej., El sistema binario Ac/Ds, en la próxima generación podría causar que el fenotipo revierta al tipo padre original, o la activación de etiquetas retrotransposónicas a través de diferentes tensiones podría multiplicar los eventos de inserción, por ejemplo, durante la micropropagación). En comparación con la MUTAGÉNESIS insercional, la inducción convencional de la conmutación (es decir, el uso de agentes físicos o químicos) proporciona la ventaja de mutaciones estables.
en teoría, la producción de bibliotecas de eliminación implica inducir eliminaciones moderadamente grandes, idealmente abarcando 1 kb a 100 kb de tamaño, en cada una de una serie de líneas.,Estas eliminaciones deben abarcar segmentos de cada gen en el repertorio genético y deben estar representadas al menos por una línea en la biblioteca de eliminaciones. Estas líneas de deleción pueden, cuando se utilizan junto con matrices de genes del genoma completo, utilizarse para identificar genes responsables de fenotipos particulares o para confirmar la Asociación de genes conocidos con fenotipos particulares.un enfoque novedoso e importante de la genética inversa es «atacar las lesiones locales inducidas en los genomas» (TILLING)., Aquí, un gran número de pequeños cambios, ya sea sustituciones de pares de bases de ADN o pequeñas eliminaciones que abarcan no más de unos pocos pares de bases, se inducen en una serie de líneas. En estas líneas, la función génica se puede determinar asociando un fenotipo con cambios en un gen particular y se pueden generar nuevos alelos de genes conocidos.
en los próximos años, nuevas tecnologías como estas tendrán un impacto creciente en el mejoramiento práctico de plantas. Sin embargo, requerirán diferentes tipos de mutaciones inducidas a frecuencias específicas., Para adaptar el proceso de mutación, será necesario comprender cómo se generan y distribuyen clases específicas de mutaciones en los genomas. En el pasado, esto no ha sido posible debido a la falta de herramientas analíticas y un conocimiento inadecuado tanto del proceso de daño del ADN como de la arquitectura de los genomas de las plantas. Además, solo se secuenció un número limitado de genes vegetales. Hoy en día, los métodos de secuenciación de ADN de alto rendimiento, junto con la bioinformática y los enfoques genómicos funcionales, proporcionan una amplia arquitectura genómica de conocimiento., La secuencia genómica completa del ADN de una planta dicotiledónea modelo, Arabidopsis, y de un monocotiledóneo modelo, el arroz, ha estado disponible recientemente. Los alsocientíficos se encuentran ahora con una serie de métodos, en su mayoría desarrollados como tecnologías de marcadores moleculares que pueden adaptarse para cuantificar los cambios en la secuencia de ADN. Con todo, la etapa está destinada a transferir la ciencia del daño al ADN inducido por mutágenos físicos y químicos de la genética humana a los sistemas vegetales., Ahora se puede utilizar una serie de tecnologías para cuantificar tanto la tasa de base subyacente, a lo largo de un número de generaciones, de mutaciones espontáneas como los efectos instantáneos de los agentes de mutación. Así, los científicos finalmente se encuentran en una posición para emprender experimentos que puedan desentrañar los tipos de mutaciones inducidas por diferentes mutágenos para que los futuros usuarios de la mutación inducida puedan usar la tecnología de una manera completamente informada.,
objetivos:
El objetivo es comprender el mecanismo de inducción de mutaciones en plantas y cuantificar los tipos (pares de bases o deleciones), frecuencias (tasas de cambio relativas a la dosis de mutágenos) y patrones (inducción de cambios en diferentes partes del genoma) de cambios en DNAinduced por una gama de mutágenos físicos y químicos en una gama de especies de plantas de cultivo clave. Se utilizarán marcadores moleculares, matriz de ADN y nuevas metodologías genéticas inversas en un enfoque único para analizar y estudiar la inducción de mutaciones provocadas en varias plantas de importancia Agronómica., Estos resultados se utilizarán para proporcionar protocolos y directrices importantes para el uso futuro de la mutación inducida en la biología de las plantas y la mejora de los cultivos. Los conocimientos obtenidos ayudarán a los Estados miembros a mejorar los programas de reproducción de cultivos mediante la aplicación de mutaciones inducidas específicas y enfoques genómicos complementarios con el objetivo de aumentar la sostenibilidad agrícola, la seguridad alimentaria y la estabilidad económica. Esta PCR aprovechará los nuevos desarrollos en análisis de ADN y genómica para definir tipos, frecuencias, tasas y patrones de mutación inducidos por los diferentes mutágenos., Esto generará una base de conocimientos que guiará y ayudará a los futuros usuarios de tecnologías de mutación inducida para el mejoramiento de cultivos y la genómica.Además, se centrará en mutágenos físicos, como la radiación gamma y de neutrones rápidos o de rayos X. También se utilizarán mutágenos químicos seleccionados para comparar la eficiencia relativa de ambos tipos de agentes mutágenos. Se evaluarán los efectos de estos mutágenos sobre semillas genéticamente homogéneas y material vegetal propagado vegetativamente.,Los principales objetivos específicos incluyen:
- determinación de mecanismos y niveles totales de daño al ADN en la generación M1, por ejemplo, directamente en semilla tratada en ensayos pre y post germinación.
- determinación de tipos, frecuencias, tasas y patrones de mutaciones en generaciones M2, sobre (a) genomas enteros y (b) en secuencias de ADN objetivo dentro de genomas.
- Determinar el tipo y la tasa de mutación espontánea a lo largo de generaciones en grupos clave de plantas de cultivo (por ejemplo, un sistema de plantas selecto, para determinar la tasa espontánea como referencia y como indicador inherente de mutagenicidad del genotipo).,
- Preparación de protocolos y directrices para el uso de mutágenos particulares para una gama de aplicaciones específicas en la mejora de cultivos y genómica.
- determinación de la base química y molecular para la sensibilidad diferencial a la radiación en diferentes variedades de la misma especie de cultivo.
- cuantificación del tipo y la tasa de mutación espontánea basal, utilizando experimentos de acumulación de mutaciones multigeneracionales.
Participantes:
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Project Officer:
P. J. L. Lagoda