¿qué es RNA-seq?
el ARN-seq (secuenciación de ARN) es una técnica que puede examinar la cantidad y las secuencias de ARN en una muestra utilizando la secuenciación de próxima generación (NGS). Analiza el transcriptoma de los patrones de expresión génica codificados dentro de nuestro ARN. Aquí, analizamos por qué el RNA-seq es útil, cómo funciona la técnica y el protocolo básico que se usa comúnmente hoy en día 1.
¿cuáles son las aplicaciones de RNA-seq?,
el ARN-seq nos permite investigar y descubrir el transcriptoma, el contenido celular total de ARN incluyendo ARNm, ARNr y ARNt. Entender el transcriptoma es clave si queremos conectar la información de nuestro genoma con su expresión proteica funcional. El RNA-seq puede decirnos qué genes se activan en una célula, Cuál es su nivel de expresión y en qué momentos se activan o apagan2. Esto permite a los científicos comprender más profundamente la biología de una célula y evaluar los cambios que pueden indicar enfermedad., Algunas de las técnicas más populares que utilizan ARN-seq son el perfilado transcripcional, la identificación SNP, la edición de ARN y el análisis de expresión génica diferente3.
esto puede dar a los investigadores información vital sobre la función de los genes. Por ejemplo, el transcriptoma puede resaltar todos los tejidos en los que se expresa un gen de función desconocida, lo que podría indicar cuál es su papel. También captura información sobre eventos de empalme alternativos (Figura 1), que producen diferentes transcripciones de una sola secuencia génica. Estos eventos no serían recogidos por secuenciación de ADN., También puede identificar modificaciones post-transcripcionales que ocurren durante el procesamiento de ARNm como la poliadenilación y 5 ‘ capping2.
Figura 1: los usos de los datos de ARN-seq utilizan lecturas cortas de ARNm que está libre de ADN intrónico no codificante. Estas lecturas deben ser alineadas de nuevo al genoma de referencia.
¿cómo actúa RNA-seq?
Las primeras técnicas de RNA-seq utilizaron la tecnología de secuenciación de Sanger, una técnica que, aunque innovadora en ese momento, también era de bajo rendimiento, costosa e inexacta., Solo recientemente, con el advenimiento y la proliferación de la tecnología NGS, hemos sido capaces de aprovechar plenamente el potencial de RNA-seq4.
el primer paso en la técnica implica convertir la población de ARN a secuenciar en fragmentos de ADNc (una biblioteca de ADNc). Esto permite que el ARN se ponga en un flujo de trabajo NGS. A continuación, se añaden adaptadores a cada extremo de los fragmentos. Estos adaptadores contienen elementos funcionales que permiten la secuenciación; por ejemplo, el elemento de amplificación y el sitio de secuenciación primario., La biblioteca de ADNc es entonces analizada por NGS, produciendo secuencias cortas que corresponden a uno o ambos extremos del fragmento. La profundidad a la que se secuenciará la biblioteca varía dependiendo de las técnicas para las que se utilizarán los datos de salida. La secuenciación a menudo sigue los métodos de secuenciación de una sola lectura o de extremo emparejado. La secuenciación de una sola lectura es una técnica más barata y más rápida (para referencia, alrededor del 1% del costo de la secuenciación de Sanger) que secuenciael ADNc desde un solo extremo, mientras que los métodos de extremo emparejado secuencian desde ambos extremos, y por lo tanto son más caros y consumen tiempo5,6.,
Se debe elegir entre protocolos específicos y no específicos. El primer método significa que la información sobre qué cadena de ADN se transcribió se conserva. El valor de la información extra obtenida de los protocolos específicos de la cadena los convierte en la opción favorable.
estas lecturas, de las cuales habrá muchos millones al final del flujo de trabajo, se pueden alinear a un genoma de referencia y ensamblar para producir un mapa de secuencia de ARN que abarque el transcriptomo7.,
RNA-seq vs microarrays: por qué RNA-seq se considera superior
RNA-seq es ampliamente considerado como superior a otras tecnologías, como la hibridación de microarrays. Hay varias razones para el estado bien considerado de RNA-seq
una planificación de protocolos de RNA-seq
la preparación antes de comenzar su experimento de RNA-seq es esencial. Las preguntas que debe responder antes de comenzar incluyen 10:
•¿Qué método de purificación de ARN está utilizando?
• * ¿Cuántas lecturas necesitará? • * ¿qué plataforma utilizarás?,
•¿Qué genoma de referencia utilizarás?
•¿Cómo está evaluando la calidad de su ARN?
• * ¿necesita enriquecer su ARN objetivo? • * ¿codificarás tu ARN?
•¿Tengo suficientes réplicas biológicas y técnicas?
•¿secuenciación de una sola lectura o de extremo emparejado?
preparación de la Biblioteca de ADNc
Después de considerar estos puntos, puede comenzar a preparar su biblioteca de ADNc. Esto requerirá agregar las «secuencias de adaptador» específicas de la plataforma y la amplificación del ADN, pero el procedimiento exacto será muy específico para la plataforma utilizada en esta etapa., La amplificación del ADN implica una primera síntesis de la cadena mediada por la transcriptasa inversa seguida de una segunda síntesis de la cadena mediada por la polimerasa del DNA 10, 11.
secuenciación de ADNc
una vez que la biblioteca esté preparada y se agreguen adaptadores, puede usar la plataforma de secuenciación elegida para secuenciar su biblioteca de ADNc a la profundidad deseada. Una vez que se hayan producido los datos de su transcripción, puede asignar los datos a su genoma de referencia., El proceso de alineación puede ser complicado por la presencia de variantes de empalme y modificaciones, y la elección del genoma de referencia utilizado también variará lo difícil que es esta etapa. Los paquetes de Software como STAR son útiles en esta etapa, al igual que las herramientas de control de calidad como Picard o Qualimap12.
Análisis de datos de RNA-Seq
Después de la etapa de alineación, puede centrarse en analizar sus datos. Herramientas como Sailfish, Rsem y BitSeq12 te ayudarán a cuantificar tus niveles de expresión, mientras que herramientas como MISO, que cuantifica genes alternativamente empalmados, están disponibles para un análisis más especializado13., Hay una biblioteca de estas herramientas por ahí, y la lectura de reseñas y redadas son su mejor manera de encontrar la herramienta adecuada para su investigación.en resumen, el ARN-seq de hoy en día está bien establecido como la opción superior a los microarrays y probablemente seguirá siendo la opción preferida por el momento.
5.https://systemsbiology.columbia.edu/genome-sequencing-defining-your-experiment
6.https://emea.illumina.com/science/technology/next-generation-sequencing/paired-end-vs-single-read-sequencing.html
9.https://cofactorgenomics.com/advantages-rna-seq-over-microarray-technology/
10.http://bioinformatics.ucdavis.edu/docs/2015-june-workshop/_downloads/Th_MB_RNASeq_Intro.pdf
11.https://rnaseq.uoregon.edu/#library-prep-stranded-libraries