Animales
todos los experimentos se llevaron a cabo con ratones C57/B6 machos y hembras no Reproductores (2-3 meses de edad). Cada sexo contribuyó a aproximadamente la mitad del número total de animales en cada experimento. Los animales fueron alojados en un ciclo de luz/oscuridad de 12/12 h y tenían acceso sin restricciones a alimentos y agua., El uso de ratones en estos experimentos fue de acuerdo con la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio y los protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité Institucional de cuidado y uso de animales de la Universidad Del Sur de California (IACUC).
exposición a la luz
Los ojos se dilataron con solución oftálmica de Tropicamida al 0,5%, USP (AKORN) y Solución Oftálmica de clorhidrato de fenilefrina al 2,5%, USP (AKORN). Los ratones se adaptaron a la oscuridad durante la noche., Fueron mantenidos en la oscuridad o expuestos a una luz fluorescente blanca fría difusa a un nivel de luminiscencia de 5000 lux durante 30 min a 1 h antes de ser sacrificados. Las muestras adaptadas a la oscuridad para ambos métodos se prepararon en un cuarto oscuro bajo luz infrarroja y todos los procedimientos que involucraban tejido adaptado a la oscuridad se realizaron utilizando un microscopio de disección equipado con convertidores de infrarrojos (B. E. Meyers & Co, Inc.). Las muestras expuestas a la luz se procesaron bajo un alcance de disección en la luz de la habitación.,
disección de Retina
Los ratones fueron sacrificados por inhalación de isoflurano seguido de dislocación cervical. Los ojos se enuclearon y las retinas se aislaron en una placa de petri de 35 × 10 mm rellena con el tampón/solución apropiado descrito a continuación. La córnea, el cristalino y el humor vítreo se retiraron de cada ojo y el epitelio pigmentado retiniano (RPE) y la esclerótica se separaron cuidadosamente de cada retina. Las retinas aisladas se hemisecaron con un bisturí de plumas en un plato de 60 × 15 mm y los bordes se recortaron para generar dos rectángulos., Minimizar la curvatura de cada retina reducida a la mitad ayudó a aplanar la retina y aseguró una exfoliación precisa de las capas retinianas. El recorte adecuado de los bordes plegables de la retina es esencial: si la retina tiene bordes plegables cuando se coloca en el papel de filtro, resultará en una disminución del rendimiento de ROS aislados y, lo que es más importante, se contaminará con otras capas retinianas.
inmunocitoquímica
antes de la enucleación, el polo superior de la córnea fue marcado por cauterización y posteriormente se retiraron la córnea, el cristalino y el vítreo., Los vasos restantes se colocaron en paraformaldehído al 4% en PBS durante 15 min y se enjuagaron 3 veces durante 10 min en PBS. Los vasos oculares fueron crioprotegidos en sacarosa al 30% en PBS durante 2 h, colocados en el compuesto tissue-Teck® O. C. T. (Sakura Finetek, EE.UU.) y rápidamente congelados en N2 líquido. Los bloques congelados se seccionaron a 10 µm en un criostato (CM 3050 S, Leica Microsystems) y se almacenaron a -80 °C. Antes de la incubación de anticuerpos, las secciones se equilibraron a temperatura ambiente (RT) durante 15 min., Para la tinción de GNAT1 utilizando el anticuerpo monoclonal de ratón TF-15, se realizó la recuperación del epítopo: las secciones se trataron durante 2 min RT con 0,02 mg/ml de proteinasa K en tampón de bloqueo (albúmina sérica bovina al 2%, suero caprino al 2%, Tritón X-100 al 0,3% en 1X PBS) y se calentaron a 65 °C durante 10 s seguido de cinco enjuagues con PBS. Luego se aplicó tampón de bloqueo a todas las secciones durante 1 h. Las secciones se incubaron con el anticuerpo de conejo contra ARR1 (c10c10 diluido 1:100 en tampón de bloqueo) o TF-15 (Citosignal, diluido 1:200 en tampón de bloqueo)., Las secciones se enjuagaron e incubaron con un anticuerpo secundario marcado con fluoresceína (laboratorios de vectores). Todas las secciones fueron luego teñidas con el anticuerpo biotinilado contra la rodopsina (1d4 diluido 1:300 en tampón de bloqueo). Las secciones se enjuagaron e incubaron con rhodamine avidina D (1:100, Vector Laboratories). Las imágenes se obtuvieron utilizando un microscopio Zeiss AxioPlan2. Se tomaron imágenes de las condiciones de luz y oscuridad utilizando tiempos de exposición idénticos.,
colección ROS por peeling secuencial con papel de filtro
el método de peeling de papel de filtro se adaptó a partir de una técnica para exponer células bipolares marcadas fluorescentemente en un soporte plano de retina para grabaciones de pinza de parche . Pelar las múltiples capas de la célula fotorreceptora con papel de filtro expone gradualmente las dendritas celulares bipolares y los cuerpos celulares para un acceso más fácil para la estimulación eléctrica y las lecturas de pinza de parche. Encontramos que los subproductos pelados, las capas de fotorreceptores que están pegadas en el papel de filtro, eran susceptibles de análisis posteriores de Western blot.,
se utilizó el medio de Ames para la manipulación de tejido retiniano vivo (Sigma-Aldrich A1420). Se prepararon dos tampones diferentes: Ames ‘- HEPES (a 1 L añadir 2,38 G HEPES, 0,877 G NaCl, pH 7,4) y Ames’-bicarbonato (a 1 L añadir 1,9 g NaHCO3, pH 7,4). Ambos se prepararon con antelación, se filtraron estériles y se almacenaron a 4 °C. Todos los procedimientos se realizaron en RT., Antes de la disección retiniana, se burbujearon 50-100 mL de Ames-HEPES con 100% de O2 en una botella de medios GibcoTM de 100 mL (Thermo Fisher, EE.UU.) y 50-100 mL de bicarbonato de Ames con 95% de O2 y 5% de CO2 en un recipiente hermético durante 15-20 min antes de su uso.
las Retinas se prepararon como se describe en la sección «disección de Retina» y se almacenaron en un recipiente hermético con bicarbonato de Ames burbujeado con 95% de O2 y 5% de CO2 para mantener el pH fisiológico., Esta condición de incubación es idéntica a la utilizada por los fisiólogos de la retina para grabaciones de electroretinogramas ex vivo o grabaciones de electrodos de succión , y puede mantener la viabilidad y funcionalidad del tejido durante varias horas. Para cada procedimiento de peeling se utilizó una pieza recortada a la mitad de retina rectangular recortada. El tejido se transfirió a través de una pipeta de transferencia de plástico de 1,7 mL (Corte de punta) a una placa de petri de 35 × 10 mm que contenía Ames-HEPES oxigenadas. El medio se actualizaba cada 10 min durante el proceso de pelado para mantener el estado oxigenado., La retina en solución se orientó con el lado del fotorreceptor hacia abajo usando pinzas y la pipeta de transferencia. Una pieza rectangular de papel de filtro de 5 mm × 2,5 mm cortada de papel de filtro VWR grado 413 (diámetro 5,5 cm, Tamaño de poro 5 µm, VWR, EE.UU.) Se colocó en la placa de petri junto a la retina. La retina se movió cuidadosamente con pinzas (sujetando ligeramente los bordes) sobre el papel de filtro con el lado del fotorreceptor hacia abajo. Una vez que la retina estaba centrada en el papel de filtro, ambos fueron cuidadosamente levantados de las Ames-HEPES., La parte inferior del papel de filtro (el lado sin la retina) fue borrado en una toalla de papel para absorber el líquido en el papel de filtro (2-3 puntos). Esto creó una adhesión segura entre las células fotorreceptoras y las fibras del papel de filtro, y este accesorio fue importante para eliminar la capa de ROS. Una gota de HEPES de Ames de la placa de petri se colocó en la retina, y el papel de filtro se secó de nuevo en la toalla de papel. Esto se repitió un total de tres veces., El papel de filtro con la retina se colocó de nuevo en la placa de petri y se sumergió, y el tejido se retiró del papel de filtro con pinzas. Se tuvo cuidado de tocar solo el perímetro extremo de la retina para preservar la integridad estructural de la retina. Para facilitar el proceso de pelado, los bordes de la retina se despegaron suavemente del papel de filtro de cada lado, aflojando la adhesión de la retina al papel de filtro., Una vez que se quitó la retina del papel de filtro, la superficie inferior del papel de filtro se secó en una toalla de papel y se colocó en un tubo etiquetado +ROS y se mantuvo en hielo. El proceso de pelado descrito anteriormente se repitió aproximadamente 7-8 veces. Después de 5 exfoliaciones, la retina se volvió más delgada, más transparente y propensa al desgarro. Después del pelado, el tubo +ROS que contenía los papeles de filtro recogidos y el resto de la retina pelada a la mitad se colocó en el tubo-ROS, se congeló en hielo seco y se almacenó a -80 °C.,
separación de compartimentos fotorreceptores mediante peeling de retina liofilizada
Este método fue adaptado del descrito por M. E. Guido, et al. , que diseñó un método de pelado de cinta ScotchTM que utilizó retinas de pollitos liofilizados para separar selectivamente la retina en diferentes capas (células fotorreceptoras, capa nuclear interna y células ganglionares)., Dado que las retinas de diferentes modelos animales tienen diferentes distribuciones de varillas y conos y pueden separarse asimétricamente con cinta después de la liofilización, adaptamos este método y exploramos su utilidad para la separación de compartimentos de varillas de retinas de ratones.
liofilización de retinas aisladas
las Retinas se prepararon como se describe en la sección «disección de Retina». Durante la disección se utilizó el timbre frío (130 mm NaCl, 3,6 mM KCl, 2,4 mM MgCl2, 1,2 mM CaCl2, 10 mM HEPES, 0,02 mM EDTA, pH 7,4). Otros tampones fisiológicos, como Ames-HEPES, también podrían ser utilizados., Debido a que a menudo se manipulaban varias muestras al mismo tiempo, las piezas de papel de filtro de 5 × 2,5 mm (Papel de filtro cualitativo de Grado 1 Whatman® (diámetro 9 cm, Tamaño de poro 11 µm, GE Healthcare, EE. Para cada muestra, se colocó una pieza rectangular de retina a la mitad en el papel de filtro utilizando una pipeta de transferencia de 1,7 mL (punta cortada) con el lado de la célula ganglionar hacia abajo y el segmento exterior del fotorreceptor hacia arriba., Una vez que el tejido se centró en el papel de filtro, ambos se levantaron del tampón del timbre y la parte inferior del papel de filtro (el lado sin la retina en él) se borró en una toalla de papel (2-3 dabs) para facilitar la fijación de la capa de células ganglionares en el papel de filtro. Una gota de Cold Ringer fue colocada en la retina, y el fondo del papel de filtro fue nuevamente borrado en la toalla de papel. Esto se repitió un total de tres veces. El buffer de Ringer fue intercambiado por un nuevo buffer de Ringer frío después de cada preparación de la muestra., El papel de filtro con la retina adjunta se colocó en una placa de petri llena de Ringer frío hasta que todas las muestras se procesaron de la misma manera. Finalmente, cada uno fue nuevamente levantado de la solución, la parte inferior del papel de filtro se secó y una gota de PBS frío se colocó en el papel de filtro junto a la retina, la parte inferior del filtro se secó nuevamente y se colocó en una placa de petri limpia y seca de 35 × 10 mm. El propósito de este paso era enjuagar el timbre más complejo con PBS para reducir la cantidad de sal seca en el tejido liofilizado., Después de que todas las muestras de tejido se habían procesado con este paso de enjuague final y se recogieron en la placa de petri limpia, la placa se envolvió firmemente con dos capas de piezas cuadradas de 2.5 × 2.5 pulgadas de papel de aluminio, con pequeños agujeros, para que las muestras de retina adaptadas a la oscuridad no se expongan a la luz, y se congelaron rápidamente en N2 líquido. Los pequeños orificios permitieron el acceso del líquido N2 al interior, llenando la placa de petri, y se tuvo cuidado de asegurar que los orificios se compensaran para que la placa de petri se envolviera a la luz., La placa de petri se colocó en un matraz Labconco de 600 mL utilizando un liofilizador VirTis Benchtop 2 K (SP Scientific, USA) durante 30 min para liofilizar el tejido.
Peeling de las capas retinianas mediante cinta ScotchTM
los tejidos retinianos liofilizados se almacenaron a -80 °C en un contenedor lleno de DrieriteTM (W. A. Hammond Drierite Co, EE.UU.) o se aislaron como tejido Agotado +ROS, +RIS y-Ros / RIS (- OIS), se congelaron nuevamente como se indicó anteriormente o se procesaron para western blots el mismo día. Todos los procedimientos de peeling se realizaron bajo la luz de la habitación. Tiras más pequeñas que 2.,Se cortaron 5 mm de ancho y se colocaron en el borde del dispensador de cinta hasta que se recortaron en piezas rectangulares. Se colocó una retina liofilizada fijada al papel de filtro Whatman® en una placa de petri limpia de 10 cm. Se cortó un pequeño trozo rectangular de cinta ScotchTM (ligeramente más grande que la superficie del tejido) y se colocó cuidadosamente sobre la retina liofilizada. Colocar la cinta encima de la retina liofilizada fue casi suficiente para unir la capa de ROS de color naranja a la cinta., Para asegurar el contacto completo del ROS con la cinta, se aplicó una ligera presión con pinzas en la parte superior de la cinta para asegurar el contacto con la superficie superior. Después de pelar cuidadosamente la cinta, la capa de Ros de color naranja se adhirió a la cinta y se separó del resto de la retina. Esta fracción fue etiquetada +ROS y colocada en un tubo de microfugio limpio. A menudo, una película delgada y blanca era visible en la superficie fracturada de la capa naranja en la primera cáscara de la cinta., Esta superficie fue removida por más peladuras de cinta hasta que fue completamente removida y el color naranja de la capa de ROS fue traído a la superficie. Esta capa blanca inicialmente unida a ROS fue colocada en un tubo separado y etiquetada + fracción RIS. Se utilizó cinta adhesiva para retirar el tejido retiniano sobrante del papel de filtro y se colocó en un tubo etiquetado con OIS., La cantidad de presión aplicada a la cinta para la exfoliación inicial de la capa de ROS teñida de naranja afectó la forma en que la muestra liofilizada se fraccionó; demasiada presión causó que toda la retina liofilizada despegara el papel de filtro sobre la cinta y muy poca presión no separó la capa naranja superior de la retina. Un par de pasadas sobre la cinta usando presión mínima con pinzas fue útil para sentir la cantidad mínima y máxima de presión para agregar a la parte superior de la cinta.,
preparación de la muestra para Western blot: pelado con papel de filtro
Los tubos +ROS que contenían los papeles de filtro se sometieron a un giro rápido en una microcentrífuga durante 2 s y se eliminó el exceso de líquido. Cada tubo se procesó individualmente (una retina dividida por la mitad) o se combinaron dos tubos (dos retinas divididas por la mitad) para obtener material más concentrado. El aislado + ROS en un solo tubo fue homogeneizado en 45-60 µL de tampón tampón RIPA frío (50 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1% desoxicolato de sodio, 0.1% SDS, 1 mM EDTA, 0.,1 m PMSF, mini inhibidor completo de proteasa (Roche Applied Sciences)), y el aislado-ROS en un solo tubo fue homogeneizado en tampón RIPA de 80-100 µL. Cuando se combinaron dos tubos, se utilizaron 80-110 µL de tampón RIPA en frío para homogeneizar +ROS y 100-150 µL de tampón en frío para-ROS. Todos los tubos fueron homogeneizados durante 1 min con un mortero autoclavado. Se tuvo mucho cuidado para asegurarse de que las piezas de papel de filtro en los tubos +ROS se mantuvieran en el lado de los tubos y permanecieran en contacto con la mano en lugar de quedarse atascadas en la parte inferior., Después de la homogeneización, se utilizaron pinzas estériles para mover las piezas de papel de filtro hacia el lado del tubo +ROS, seguido de un giro de 2-4 s en la microcentrífuga. Este espín extraía el líquido del papel, y el líquido se transfirió a un tubo limpio y se procesó para Western blot como se describe a continuación. Este fue el paso más lento, y si no se realiza correctamente, gran parte de la muestra puede terminar siendo absorbida por los trozos de papel de filtro. Para maximizar la recuperación de la muestra, el tamaño de las piezas de papel de filtro utilizadas para las cáscaras debe recortarse para que coincida con el área del tejido retiniano.,
preparación de la muestra: peeling con cinta ScotchTM
Similar al método de peeling de filtro, se combinaron dos tubos, cada uno con una capa pelada de media retina, para aumentar la concentración de proteínas. Las muestras +ROS y +RIS se homogeneizaron en 100-115 µL, y las muestras-OIS en 125 µL de tampón RIPA frío. Todos los tubos fueron homogeneizados durante 1 min. Se tuvo mucho cuidado para asegurarse de que la cinta en los tubos +ROS, +RIS y-OIS permaneciera en contacto con el mortero y que la cinta se mantuviera en el lado de los tubos en lugar de atascarse en la parte inferior., Después de la homogeneización, se utilizaron pinzas estériles para mover trozos de cinta al lado de los tubos. Los tubos se hilaron en la mini centrifugadora durante 2-4 s, después de lo cual se retiraron cuidadosamente los trozos de cinta seca.
cuantificación de proteínas, electroforesis en gel e inmunoblots proteicos
se utilizó un BCA protein assay kit (Thermo Scientific, USA) para determinar la cantidad total de proteínas en cada muestra. Se añadieron dos microlitros de DNaseI (10 unidades/µL, Roche, Suiza) a las muestras y se dejaron a temperatura ambiente durante 30 min., Se añadió al homogeneizado un volumen apropiado de 4x tampón de muestra SDS (40% glicerol, 240 mM Tris Base pH 6,8, 8% SDS, 5% ßME, 0,04% azul de bromofenol).,tr>
Approximately 10 μg of protein lysate was loaded per lane and separated on a pre-cast polyacrylamide Bis-Tris gel with a 4–12% gradient (Life Technologies, USA) and transferred onto nitrocellulose membrane., Las membranas se bloquearon en el tampón de leche al 10% / TBS – T durante 1 h en la RT, y se incubaron durante la noche con los siguientes anticuerpos: anticuerpo anti-ARR1 de conejo (1:1000, ref), anticuerpo monoclonal anti-GNAT1 de ratón (TF-15, 1:1000, Citosignal), anticuerpo anti-actina β De Conejo (1: 5000, GeneTex Inc.), anticuerpo anti-RGS9 de conejo (1:1000), anticuerpo policlonal anti-gß5l/s de conejo (CT215) (1:2000) y anticuerpo policlonal anti-citocromo C de conejo (1: 500, Santa Cruz, sc-7159). Las membranas se incubaron con anticuerpos secundarios marcados fluorescentemente (1: 10.000, LI-COR Biosciences) en RT durante 1 h., Las bandas de proteínas Fueron detectadas por el sistema de imagen infrarroja Odyssey® (LI – COR Biosciences, EE. UU.) y la intensidad de fluorescencia de las bandas individuales se cuantificó mediante ImageJ. Las señales GNAT1, ARR1 y RGS9 se normalizaron contra Gß5L para muestras +ROS, +RIS y contra actina para muestras-ROS y-OIS. Para cada experimento independiente, las señales fluorescentes para cada proteína en cada compartimiento también se normalizaron contra las señales combinadas de todos los compartimientos retinianos. Para determinar las diferencias entre los dos grupos se utilizaron pruebas t no apareadas de 2 colas.