El suero bovino Fetal (FBS) es la fracción líquida de sangre coagulada de terneros fetales, agotada de células, fibrina y factores de coagulación, pero que contiene un gran número de factores nutricionales y macromoleculares esenciales para el crecimiento celular. La albúmina sérica bovina es el componente principal del FBS. Los factores de crecimiento en FBS son esenciales para el mantenimiento y crecimiento de las células cultivadas . El FBS también contiene una variedad de moléculas pequeñas como aminoácidos, azúcares, lípidos y hormonas.
FBS se utiliza en una amplia gama de aplicaciones., Uno de los usos principales del FBS es en el cultivo celular eucariótico, con concentraciones de hasta el 20% o incluso más, donde proporciona muchos nutrientes esenciales y factores de crecimiento que facilitan la supervivencia y proliferación celular. Sin embargo, es importante tener en cuenta que el FBS en cultivos de células humanas puede introducir artefactos de investigación; las células humanas cultivadas con sueros humanos se comportan de manera diferente a las cultivadas con FBS ., El FBS también se usa en la investigación, fabricación y control de vacunas humanas y veterinarias y de medicamentos biotecnológicos, y se usa para detener la digestión de tripsina o para servir como protector en la criopreservación . Los medios de cultivo celular sin suero han estado en uso durante muchos años. El suero bovino Fetal podría no ser el mejor suplemento para el cultivo celular. Por ejemplo, la albúmina sérica bovina con selenito de insulina-transferrina-sodio y/o factor de crecimiento epidérmico en medio de cultivo mejora la calidad del embrión bovino y la invasión trofoblástica en comparación con el suero fetal bovino .
El suero Fetal contiene más factores de crecimiento y tiene menor contenido de gammaglobulina (es decir, anticuerpos) y suero no fetal. Estos son importantes porque los factores de crecimiento facilitan la supervivencia y proliferación celular, mientras que los anticuerpos podrían unirse a las células en cultivo. Además, el suero fetal contiene niveles más bajos de proteínas del complemento (complementos) que los de adultos o recién nacidos. Estos complementos tienen los efectos indeseables de lisar las células en cultivo e interferir con los inmunoensayos.
tanto el suero como el plasma se derivan de la sangre completa mediante el uso de centrifugación para eliminar componentes, incluidos los glóbulos rojos. La diferencia entre el plasma y el suero es que las proteínas de coagulación están presentes en el plasma pero se han eliminado del suero. El Plasma generalmente se prepara agregando anticoagulantes a la sangre antes de la centrifugación, pero las proteínas de coagulación no se eliminan. El suero se prepara permitiendo que la sangre coagule antes de la centrifugación o por centrifugación extensa / progresiva. Por lo tanto, el fibrinógeno y las proteínas asociadas con la coagulación no están presentes en el suero.,
en humanos, las siguientes 22 proteínas comprenden el 99% del contenido total de proteínas en suero y plasma: albúmina, IgG total, transferrina, fibrinógeno, IgA total, alfa-2-macroglobulina, IgM total, alfa-1-antitripsina, complemento C3, haptoglobulina, alfa-1-glicoproteína ácida, apolipoproteína-B, apolipoproteína-A1, lipoproteína (a), factor H, ceruloplasmina, complemento C4, complemento factor B, pre-albúmina, complemento C9, complemento C1Q y complemento C8 . El 1% restante incluye cientos de proteínas., La proteína sérica más abundante, la albúmina, a 50 mg/ml, comprende aproximadamente la mitad de la masa proteica total .
La Asociación Internacional de la industria del suero (siaa; www.serumindustry.org), una organización comercial de proveedores de suero, estableció directrices para la estandarización del control de calidad. Estas directrices requieren que las siguientes pruebas se realicen utilizando metodologías específicas, y los resultados de las pruebas deben estar disponibles como certificado de análisis (Tabla 1).,h>Test
bacterias y hongos – pruebas de esterilidad
micoplasma
agentes citopáticos – pruebas virales
agentes hemadsorbentes – pruebas virales
diarrea del virus bovino – pruebas virales
medición del pH
osmolalidad
proteína total, determinada por método biuret
endotoxina
hemoglobina
patrón electroforético
pruebas de rendimiento, como cultivo de células madre
inmunodifusión radial
inmunoglobulina
gamma-glutamil transferasa (GGT)
cuadro 1., Requisitos mínimos de las pruebas séricas.
las endotoxinas, también llamadas lipopolisacárido (LPS) o lipooligosacárido (LOS), provienen de las membranas externas de las bacterias gramnegativas y contribuyen a las manifestaciones clínicas de una variedad de bacterias gramnegativas patógenas. In vivo, las endotoxinas inducen fiebre y la respuesta inflamatoria mientras que en cultivo celular introducen variación en las respuestas celulares.
Los niveles de endotoxina se miden mediante la prueba de lisato de amebocitos de limulus (Lal)., Los amebocitos son análogos a los glóbulos blancos en vertebrados y el LAL se prepara a partir de la sangre de Limulus polyphemus (cangrejo herradura americano; Figura 1). LAL es muy sensible a las endotoxinas y se coagula en presencia de incluso una cantidad mínima de endotoxina. El estado de conservación del cangrejo herradura americano ha sido evaluado y discutido en la cultura popular . Muchas de las poblaciones de cangrejos Herradura están en riesgo y por lo tanto se debe tener cuidado para protegerlos de la pérdida.
a continuación analizamos algunos de los sueros de especialidad de uso común. Los preparados séricos dedicados a temas de investigación específicos , como el suero deficiente en lipoproteínas de Kalen Biomedical para la investigación del colesterol, o para sistemas especializados de expresión génica , como el suero fetal bovino tamizado con tetraciclina, no se discuten.
El FBS Regular contiene un gran número de vesículas extracelulares, algunas de las cuales son exosomas ., Cuando se realiza investigación de exosomas con células cultivadas, es fundamental usar FBS sin exosomas. Sin embargo, es importante tener en cuenta que los FBS agotados por exosomas pueden afectar y apoyar el crecimiento celular de manera diferente a los FBS regulares . Los FBS agotados por exosomas pueden comprarse directamente a varios proveedores comerciales o prepararse a través de ultracentrifugación o ultrafiltración, aunque los efectos de los procesos de agotamiento y/o las fuentes comerciales pueden no ser consistentes en términos de crecimiento celular y fisiología .,
otros componentes de FBS pueden agotarse, dependiendo de los requisitos experimentales. Por ejemplo, Galmozzi A et al agotaron heme de FBS con ácido ascórbico .
un tratamiento común del FBS es la inactivación térmica, donde el FBS se calienta a 56°C durante 30 minutos en un baño de agua con agitación ocasional. El propósito es inactivar cualesquiera componentes del sistema del complemento están presentes en el FBS, y otros inhibidores desconocidos potenciales del crecimiento de la célula., Anteriormente, la inactivación por calor también estaba destinada a eliminar la contaminación por micoplasma, lo que ya no es un problema ya que todos los productos séricos ahora se filtran a través de tamaños de poros lo suficientemente pequeños como para eliminar el micoplasma. Cabe señalar que la inactivación por calor también puede tener efectos no deseados, como la reducción de la capacidad de las células cultivadas para adherirse a las superficies .
varios Proveedores han instado a los usuarios a no inactivar el FBS por calor para la mayoría de las necesidades de cultivo celular., En cada caso es aconsejable evaluar la necesidad de inactivación por calor en una aplicación particular, ya que diferentes células tienen diferentes respuestas hacia la inactivación por calor de FBS .
además, como todos los demás protocolos con respecto a FBS, el proceso de inactivación de calor debe hacerse con cuidado, ya que una temperatura demasiado alta o un calentamiento prolongado inactivarán los factores de crecimiento y generarán precipitados.
hy Chew et al mantuvieron A431, HCC1569, MCF7, MDA-MB-231, MDA-MB-468, SCC25, SKBR3, T47D, RENCA y CT26.Líneas celulares WT en medios con 10% (v/v) de FBS inactivado por calor ., Freeman SA et al utilizaron FBS inactivados por calor en todo su estudio sobre macrófagos . Aikawa T et al cultivaron células gliales primarias de ratón en matraces recubiertos de poli-D-lisina en DMEM que contenían 10% de FBS inactivados por calor de Miliporesigma (F2442) . Feldman D et al cultivaron células HEK293FT en DMEM suplementadas con suero fetal bovino inactivado por calor de Seradigm (97068-085), y células A549, HCT116, HT1080, A375 con suero fetal bovino inactivado por calor de Sigma (F4135) para evaluar pantallas combinadas ópticas ., Kulkarni S et al mantuvieron células Hut-78 con suero fetal bovino inactivado por calor de Atlanta Biologicals .
El carbón activado puede unirse a moléculas lipofílicas y, por lo tanto, se ha utilizado para eliminar hormonas como andrógenos, estradiol, progesterona, cortisol, testosterona, triyodotironina (T3) y tiroxina (T4) de FBS. Estas hormonas lipídicas en suero tienden a interferir con los sistemas de inmunoensayo y los métodos de ensayo de insulina. L Zhao et al midieron el crecimiento de células tumorales en medios de cultivo suplementados con suero al 10% despojado de carbón vegetal .,
la diálisis puede eliminar todas las moléculas con un peso molecular inferior a 10,000 MW de FBS. Esto incluye moléculas polares y no polares. Se eliminan las hormonas, las citocinas, la glucosa, los aminoácidos y muchos otros. La diálisis también elimina antibióticos y otras moléculas exógenas en FBS.
se utilizó FBS dializado de Thermo Fisher Scientific en el cultivo de adenocarcinoma ductal pancreático para el estudio de espectrometría de masas SILAC y otros estudios SILAC , y en el cultivo de células HeLa con pulso analógico L-AHA de MET para la detección química de clics de proteínas de larga vida .,
la irradiación Gamma puede ser parte del proceso para esterilizar FBS. El FBS generalmente se filtra a través de filtros de 0.1 um varias veces para eliminar microorganismos. La irradiación Gamma puede inactivar los virus comúnmente presentes en las especies bovinas. Sin embargo, algunas especies virales, como el parvovirus, son resistentes a la irradiación gamma.
aunque FBS tiene un contenido IgG bastante bajo, incluso este nivel puede ser demasiado alto para algunas aplicaciones determinadas. El nivel de IgG se puede reducir sustancialmente mediante la cromatografía de captura., El FBS con IgG bajo se utiliza para la producción del anticuerpo, la síntesis recombinante de la proteína y otras aplicaciones.
el cultivo de células madre tiene requisitos estrictos en términos de factores de crecimiento. Algunos de los factores de crecimiento presentes en el FBS promueven la diferenciación de células madre. Varias compañías ofrecen células madre embrionarias calificadas FBS destinadas a mantener células madre indiferenciadas. Sin embargo, es importante probar lotes específicos de FBS para su aplicabilidad en el mantenimiento de la pluripotencia/totipotencia de diferentes tipos de células madre., Thermo Fisher proporciona células madre embrionarias calificadas FBS, como, por ejemplo, utilizado en el cultivo de células ES de ratón e14tg2a por Yasuda S et al .
los Principales ganado países son los principales proveedores de FBS. Los países incluyen los EE.UU., Australia, Nueva Zelanda, Canadá, varios en América del Sur y Central.
la producción y recolección de productos séricos están reguladas por agencias gubernamentales. El FBS está etiquetado como grado USDA o grado Europeo., Los FBS DE GRADO USDA se pueden importar a cualquier país libre de encefalopatía espongiforme bovina y enfermedades de la fiebre aftosa, mientras que los FBS de grado Europeo se pueden vender en la mayoría de los países europeos y asiáticos.
El FBS se almacena mejor congelado, entre -5 y -20°C, y se puede descongelar a una temperatura entre 2 y 8°c. a menudo es útil alícuota y congelar el suero en porciones más pequeñas, a menudo tubos de 50 ml, para evitar muchos ciclos de congelación y descongelación. Ocasionalmente, algunas alícuotas de FBS permanecen en un líquido a temperaturas de congelación., Esto se debe a la falta de un centro de nucleación (materia particulada) para que comience la cristalización (congelación). Si simplemente golpeas los tubos con el dedo, por lo general se solidifican casi al instante.
es común tener algo de precipitado después de la descongelación. Los precipitados, probablemente debido a la desnaturalización de algunas de las proteínas séricas, se pueden eliminar por centrifugación breve, y esto generalmente no afecta la calidad del suero.
muchos proveedores proporcionan FBS con diferentes grados, país de origen y tratamiento., FBS, en sí, es una mezcla compleja, y la variabilidad entre diferentes grados, proveedores y lotes es de esperar. Por lo tanto, es esencial establecer un proceso de selección y evaluación de FBS. Es una buena idea examinar la literatura para determinar cómo una selección particular de FBS fue utilizada previamente en investigaciones similares, o para el mismo cultivo celular y prestar mucha atención a la Posible variación lote a lote en el FBS. Para ayudar con esto, Labome ha realizado una encuesta sobre el uso de FBS de publicaciones científicas, que se analiza a continuación, para ayudar a nuestros visitantes a seleccionar el FBS más adecuado.,
Labome examina la literatura para los materiales utilizados. Aquí se resumen las publicaciones que citaron el suero fetal bovino. Las publicaciones son un subconjunto aleatorio de más de 10.000 publicaciones.
Los principales proveedores de FBS son Life Technologies (ahora parte de Thermo Fisher Scientific), Thermo Fisher Scientific Hyclone (ahora parte de GE LifeScience) y Milliporesiigma (Tabla 2).
Life Technologies es una compañía global de biotecnología con sede en Carlsbad, California., Se formó en 2008 con la fusión de Invitrogen Corporation y Applied Biosystems Inc. Muchos de sus productos están bajo la marca Gibco. Proporcionan productos de cultivo celular, como medio de cultivo celular, FBS y otros reactivos relevantes. La compañía se fusionó con Thermo Fisher Scientific en 2014.
El FBS de Life Technologies se ha utilizado para estudiar el nucléolo como una entidad de control de calidad de proteínas separadas por fases en células HEK293T y hela ., Pandolfini L et al cultivaron células HEK293T y A549 en DMEM suplementadas con 10% Gibco FBS (10270-106) y células Caco-2 en medio esencial mínimo de Eagle suplementadas con 20% Gibco FBS (10270-106) . Las células HEK293T se mantienen muy a menudo con 10% de suero bovino fetal de Thermo Fisher .
GE Healthcare Hyclone FBS es ampliamente utilizado. De Cecco M et al lo utilizaron al 15% para mantener los fibroblastos senescentes LF1, IMR-90 y WI-38 en medios Ham F-10 ., Nicetto D et al utilizaron Hyclone FBS (SH30071) para terminar la digestión de tripsina y mantener las células embrionarias . Laflamme C et al mantuvieron células HEK-293 en DMEM con alto contenido de glucosa de GE Healthcare (SH30081.01) que contenían 10% de suero de ternero bovino de GE Healthcare (SH30072.03) .
Frohner IE et al mantuvieron células Neuro-2a (N2a) y Cos-7 de la colección de cultivos de tipo americano en DMEM que contenían 10% de FBS de Bovogen, Francia . Laflamme C et al cultivaron células U2OS en suero bovino fetal libre de tetraciclina de DMEM con alto contenido de glucosa al 10% de Wisent (081150) . Dong JX et al mantuvieron cultivos primarios de hipocampo en Matrigel de Corning con 5% de suero fetal bovino de Atlanta Biologicals (S11550) ., Lee A et al cultivaron mioblastos murinos c2c12 con DMEM suplementado con suero bovino fetal al 10% de VWR (89510-186) . Zhao n et al cultivaron células U2OS de ATCC (HTB-96) en medio DMEM con suero bovino fetal al 10% (v/v) de Altas Biologicals . Liu X et al cultivaron células murinas 4T1 en Dmemsupplementadas con 10% de suero fetal bovino de Biochrom .