Fetales Rinderserum (FBS) ist die flüssige Fraktion von geronnenem Blut von fetalen Kälbern, die von Zellen, Fibrin und Gerinnungsfaktoren erschöpft ist, jedoch eine große Anzahl von ernährungsphysiologischen und makromolekularen Faktoren enthält, die für das Zellwachstum unerlässlich sind. Rinderserumalbumin ist der Hauptbestandteil von FBS. Wachstumsfaktoren in FBS sind für die Erhaltung und das Wachstum von kultivierten Zellen unerlässlich . FBS enthält auch eine Vielzahl kleiner Moleküle wie Aminosäuren, Zucker, Lipide und Hormone.
FBS wird in einer Vielzahl von Anwendungen eingesetzt., Eine der Hauptanwendungen von FBS ist die eukaryotische Zellkultur mit Konzentrationen von bis zu 20% oder mehr, wo es viele essentielle Nährstoffe und Wachstumsfaktoren liefert, die das Überleben und die Proliferation von Zellen erleichtern. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass FBS in menschlichen Zellkulturen Forschungsartefakte einführen kann; Mit menschlichen Seren kultivierte menschliche Zellen verhalten sich anders als mit FBS kultivierte ., FBS wird auch in der Forschung, Herstellung und Kontrolle von Human-und Tierimpfstoffen sowie von Biotech-Arzneimitteln verwendet und verwendet, um die Trypsinverdauung zu stoppen oder als Schutzmittel bei der Kryokonservierung zu dienen . Zellkulturmedien ohne Serum sind seit vielen Jahren im Einsatz. Fetales Rinderserum ist möglicherweise nicht die beste Ergänzung für die Zellkultur. Zum Beispiel verbessert Rinderserumalbumin mit Insulintransferrin-Natriumselenit und/oder epidermalem Wachstumsfaktor im Kulturmedium die Rinderembryoqualität und die Trophoblasteninvasion im Vergleich zu fetalem Rinderserum .
Fetales Serum enthält mehr Wachstumsfaktoren und hat einen niedrigeren Gammaglobulingehalt (d. H. Antikörper) und nicht-fetales Serum. Diese sind wichtig, weil die Wachstumsfaktoren das Überleben und die Proliferation der Zellen erleichtern, während Antikörper an die Zellen in Kultur binden könnten. Darüber hinaus enthält fetales Serum niedrigere Mengen an Komplementproteinen (Ergänzungen) als solche von Erwachsenen oder Neugeborenen. Diese Ergänzungen haben die unerwünschten Wirkungen von lysierenden Zellen in Kultur und stören Immunoassays.
Serum und Plasma werden beide aus Vollblut gewonnen, indem Komponenten einschließlich roter Blutkörperchen durch Zentrifugation entfernt werden. Der Unterschied zwischen Plasma und Serum besteht darin, dass Gerinnungsproteine im Plasma vorhanden sind, aber aus dem Serum entfernt wurden. Plasma wird im Allgemeinen durch Zugabe von Antikoagulanzien zum Blut vor der Zentrifugation hergestellt, aber die Gerinnungsproteine werden nicht entfernt. Das Serum wird hergestellt, indem das Blut vor der Zentrifugation oder durch ausgedehnte/fortschreitende Zentrifugation gerinnen kann. Daher sind Fibrinogen und mit der Gerinnung assoziierte Proteine im Serum nicht vorhanden.,
Beim Menschen umfassen die folgenden 22 Proteine 99% des Gesamtproteingehalts von Serum und Plasma: Albumin, Gesamt-IgG, Transferrin, Fibrinogen, Gesamt-IgA, Alpha-2-Makroglobulin, Gesamt-IgM, Alpha-1-Antitrypsin, C3-Komplement, Haptoglobulin, Alpha-1-Säure-Glykoprotein, Apolipoprotein-B, Apolipoprotein-A1, Lipoprotein (a), Faktor H, Ceruloplasmin, C4-Komplement, Komplementfaktor B, Präalbumin, C9-Komplement, C1q-Komplement und C8-Komplement . Die restlichen 1% enthalten Hunderte von Proteinen., Das am häufigsten vorkommende Serumprotein Albumin umfasst mit 50 mg/ml etwa die Hälfte der gesamten Proteinmasse .
Die Internationale Serum Industry Association (ISIA; www.serumindustry.org), a trade organization of serum Anbieter, Richtlinien für die Qualitätskontrolle Standardisierung. Diese Richtlinien erfordern, dass die folgenden Tests mit bestimmten Methoden durchgeführt werden, und die Testergebnisse müssen als Analysezertifikat verfügbar sein (Tabelle 1).,h>Test
Bakterien und Pilze – Sterilitätsprüfung
Mycoplasma
zytopathische Mittel – virale Tests
hämadsorbierende Mittel – virale Tests
Rindervirus Durchfall – virale Tests
pH-Messung
Osmolalität
Gesamtprotein, bestimmt durch die Biuret-Methode
Endotoxin
Hämoglobin
elektrophoretisches Muster
Leistungstests, wie Stammzellkultur
radiale Immundiffusion
Immunglobulin
Gamma-Glutamyltransferase (GGT)
Tabelle 1., Mindestanforderungen an Serumtests.
Endotoxine, auch Lipopolysaccharid (LPS) oder Lipoligosaccharid (LOS) genannt, stammen aus den äußeren Membranen gramnegativer Bakterien und tragen zu den klinischen Manifestationen einer Vielzahl pathogener gramnegativer Bakterien bei. In vivo induzieren Endotoxine Fieber und die Entzündungsreaktion, während sie in Zellkultur Variationen der zellulären Reaktionen hervorrufen.
Endotoxinspiegel werden durch den Limulus Amebocyte Lysate (LAL) Test gemessen., Amebozyten sind analog zu weißen Blutkörperchen bei Wirbeltieren und LAL wird aus dem Blut von Limulus polyphemus hergestellt (amerikanische Hufeisenkrabbe; Abbildung 1). LAL ist sehr empfindlich gegenüber Endotoxinen und koaguliert in Gegenwart einer winzigen Menge Endotoxin. Der Erhaltungszustand der amerikanischen Hufeisenkrabbe wurde in der Populärkultur bewertet und diskutiert . Viele der Hufeisenkrabbenpopulationen sind gefährdet und daher sollte darauf geachtet werden, sie vor Verlust zu schützen.
Im Folgenden werden einige häufig verwendete Spezialseren beschrieben. Serumpräparate, die spezifischen Forschungsthemen gewidmet sind , wie Lipoprotein-Mangel-Serum von Kalen Biomedical für die Cholesterinforschung oder für spezialisierte Genexpressionssysteme, wie Tetracyclin-gescreent fetales Rinderserum , werden nicht diskutiert.
Regelmäßige FBS enthält eine große Anzahl von extrazellulären Vesikeln, von denen einige Exosomen sind ., Bei der Exosomenforschung mit kultivierten Zellen ist es wichtig, FBS ohne Exosomen zu verwenden. Es ist jedoch wichtig zu wissen, dass Exosom-abgereichertes FBS das Zellwachstum anders beeinflussen und unterstützen kann als normales FBS . Exosomen-erschöpfte FBS können entweder direkt von mehreren kommerziellen Lieferanten gekauft oder entweder durch Ultrazentrifugation oder Ultrafiltration hergestellt werden, obwohl die Auswirkungen der Erschöpfungsprozesse und/oder der kommerziellen Quellen in Bezug auf Zellwachstum und Physiologie möglicherweise nicht konsistent sind .,
Andere Komponenten von FBS können je nach experimentellen Anforderungen erschöpft sein. Zum Beispiel Galmozzi A et al abgereichertes Häm aus FBS mit Ascorbinsäure .
Eine gängige Behandlung von FBS ist die Hitzeinaktivierung, bei der FBS 30 Minuten lang in einem Wasserbad mit gelegentlichem Schütteln auf 56°C erhitzt wird. Der Zweck besteht darin , alle Komponenten des Komplementsystems, die im FBS vorhanden sind, und andere potenzielle unbekannte Inhibitoren des Zellwachstums zu inaktivieren., Zuvor war die Hitzeinaktivierung auch dazu gedacht, Mykoplasmenkontaminationen zu entfernen, was kein Problem mehr darstellt, da alle Serumprodukte jetzt durch Porengrößen gefiltert werden, die klein genug sind, um Mykoplasmen zu entfernen. Es ist anzumerken, dass die Wärme-Inaktivierung auch unerwünschte Wirkungen haben kann, wie z. B. die Verringerung der Fähigkeit kultivierter Zellen, sich an Oberflächen anzuhaften .
Mehrere Anbieter haben die Benutzer aufgefordert, FBS für die meisten Zellkulturanforderungen nicht zu inaktivieren., In jedem Fall ist es ratsam, den Bedarf an Wärmeinaktivierung in einer bestimmten Anwendung zu bewerten, da verschiedene Zellen unterschiedliche Reaktionen auf die Wärmeinaktivierung von FBS haben .
Darüber hinaus muss wie bei allen anderen Protokollen in Bezug auf FBS der Wärmeinaktivierungsprozess mit Vorsicht durchgeführt werden, da eine zu hohe Temperatur oder eine längere Erwärmung Wachstumsfaktoren inaktiviert und Ausfälle erzeugt.
HY Chew et al gepflegt A431, HCC1569, MCF7, MDA-MB-231, MDA-MB-468, SCC25, SKBR3, T47D, RENCA und CT26.WT-Zelllinien in Medien mit 10% (v/v) hitzeinaktiviertem FBS ., Freeman SA et al. verwendeten in ihrer Studie an Makrophagen hitzeinaktiviertes FBS durchgehend . Aikawa T et al kultivierte primäre Gliazellen der Maus auf poly-D-Lysin-beschichteten Flaschen in DMEM, die 10% hitzeinaktiviertes FBS aus MilliporeSigma (F2442) enthalten . Feldman D et al kultivierte HEK293FT-Zellen in DMEM, ergänzt mit hitzeinaktiviertem fetalem Rinderserum aus Seradigm (97068-085) und A549, HCT116, HT1080, A375-Zellen mit hitzeinaktiviertem fetalem Rinderserum aus Sigma (F4135), um optische gepoolte Bildschirme zu bewerten ., Kulkarni S et al. pflegten Hut-78-Zellen mit hitzeinaktiviertem fetalem Rinderserum aus Atlanta Biologicals .
Aktivkohle kann an lipophile Moleküle binden und wurde daher verwendet, um Hormone wie Androgen, Estradiol, Progesteron, Cortisol, Testosteron, Trijodthyronin (T3) und Thyroxin (T4) aus FBS zu entfernen. Diese Serumlipidhormone neigen dazu, Immunoassay-Systeme und Insulin-Assay-Methoden zu stören. L Zhao et al maß das Tumorzellwachstum in Kulturmedien, ergänzt mit 10% Kohlestreifen-Serum .,
Die Dialyse kann alle Moleküle mit einem Molekulargewicht von weniger als 10.000 MW aus FBS entfernen. Dies umfasst sowohl polare als auch unpolare Moleküle. Hormone, Zytokine, Glukose, Aminosäuren und viele andere werden entfernt. Die Dialyse entfernt auch Antibiotika und andere exogene Moleküle in FBS.
Dialysiertes FBS von Thermo Fisher Scientific wurde in der Kultur des Pankreas-duktalen Adenokarzinoms für SILAC-Massenspekulationsstudien und andere SILAC-Studien sowie in der Kultur von HeLa-Zellen mit Met-analogem l-AHA-Pulswert für den chemisch-chemischen Nachweis langlebiger Proteine verwendet .,
Gamma-Bestrahlung kann Teil des Prozesses zur Sterilisation von FBS sein. FBS wird normalerweise mehrmals durch 0,1 um-Filter gefiltert, um Mikroorganismen zu eliminieren. Gamma-Bestrahlung kann die Viren, die häufig in Rindern inaktivieren. Einige Virusarten wie Parvovirus sind jedoch resistent gegen Gammastrahlung.
Obwohl FBS einen recht niedrigen IgG-Gehalt aufweist, kann selbst dieses Niveau für einige bestimmte Anwendungen zu hoch sein. Der IgG-Spiegel kann durch Capture-Chromatographie wesentlich weiter reduziert werden., FBS mit niedrigem IgG wird für Antikörperproduktion, rekombinante Proteinsynthese und andere Anwendungen verwendet.
Stammzellkultur hat hohe Anforderungen an Wachstumsfaktoren. Einige der in FBS vorhandenen Wachstumsfaktoren fördern die Stammzelldifferenzierung. Mehrere Unternehmen bieten qualifizierte FBS für embryonale Stammzellen an, um undifferenzierte Stammzellen aufrechtzuerhalten. Es ist jedoch wichtig, bestimmte Partien von FBS auf ihre Anwendbarkeit bei der Aufrechterhaltung der Pluripotenz/Totipotenz verschiedener Stammzelltypen zu testen., Thermo Fisher liefert embryonale stammzellqualifizierte FBS, wie sie beispielsweise in der E14TG2a-Maus-ES-Zellkultur von Yasuda S et al.
Die wichtigsten Rinderländer sind die wichtigsten Anbieter von FBS. Den Ländern gehören die USA, Australien, Neuseeland, Kanada, mehrere in Süd-und Mittelamerika.
Die Herstellung und Sammlung von Serumprodukten wird von Regierungsbehörden geregelt. FBS ist als USDA-Grade oder European-Grade gekennzeichnet., USDA-Grade FBS kann in jedes land importiert werden frei von bovine spongiforme enzephalopathie und fuß und mund krankheiten, während Europäischen-Grade FBS kann verkauft werden in den meisten Europäischen und Asiatischen ländern.
FBS wird am besten gefroren zwischen -5 und -20°C gelagert und kann bei einer Temperatur zwischen 2 und 8°C aufgetaut werden Es ist oft nützlich, das Serum in kleineren Portionen, oft 50 ml Röhrchen, auszurichten und einzufrieren, um viele Gefrier-und Auftauzyklen zu vermeiden. Gelegentlich bleiben einige Aliquots von FBS bei Gefriertemperaturen in einer Flüssigkeit., Dies ist auf das Fehlen eines Keimbildungszentrums (Partikel) zurückzuführen, mit dem die Kristallisation (Einfrieren) beginnen kann. Wenn Sie die Röhrchen einfach mit dem Finger umdrehen, verfestigen sie sich normalerweise fast sofort.
Es ist üblich, nach dem Auftauen etwas Niederschlag zu haben. Die Fällungen, wahrscheinlich aufgrund der Denaturierung einiger Serumproteine, können durch kurze Zentrifugation beseitigt werden, was im Allgemeinen die Qualität des Serums nicht beeinträchtigt.
Viele Lieferanten liefern FBS mit unterschiedlichen Qualitäten, Herkunftsland und Behandlung., FBS selbst ist eine komplexe Mischung, und Variabilität zwischen verschiedenen Sorten, Lieferanten und Losen ist zu erwarten. Daher ist es wichtig, einen Prozess für die Auswahl und Bewertung von FBS festzulegen. Es ist eine gute Idee, die Literatur zu untersuchen, um festzustellen, wie eine bestimmte Auswahl von FBS zuvor in ähnlichen Forschungen oder für dieselbe Zellkultur verwendet wurde, und um genau auf mögliche Lot-to-Lot-Variationen in den FBS zu achten. Um dies zu unterstützen, hat Labome eine Umfrage zur Verwendung von FBS aus wissenschaftlichen Publikationen durchgeführt, die unten diskutiert wird, um unseren Besuchern bei der Auswahl der am besten geeigneten FBS zu helfen.,
Labome erhebt Literatur zu den verwendeten Materialien. Hier sind die Veröffentlichungen zusammengefasst, die fetales Rinderserum zitierten. Die Publikationen sind eine zufällige Teilmenge von über 10.000 Publikationen.
Die wichtigsten Anbieter von FBS sind Life Technologies (jetzt Teil von Thermo Fisher Scientific), Thermo Fisher Scientific Cyclone (jetzt Teil von GE LifeScience) und MilliporeSigma (Tabelle 2).
Life Technologies ist ein globales Biotechnologie-Unternehmen mit Hauptsitz in Carlsbad, Kalifornien., Es wurde 2008 mit der Fusion der Invitrogen Corporation und Applied Biosystems Inc. gegründet. Viele ihrer Produkte stehen unter dem Markennamen Gibco. Sie liefern Zellkulturprodukte wie Zellkulturmedium, FBS und andere relevante Reagenzien. Das Unternehmen fusionierte 2014 mit Thermo Fisher Scientific.
FBS von Life Technologies wurde verwendet, um Nucleolus als phasentrennte Proteinqualitätskontrolleinheit in HEK293T-und HeLa-Zellen zu untersuchen ., Pandolfini L et al kultivierten HEK293T-und A549-Zellen in DMEM, ergänzt mit 10% Gibco FBS (10270-106) und Caco-2-Zellen in Eagle ‚ s Minimum Essential Medium, ergänzt mit 20% Gibco FBS (10270-106) . HEK293T-Zellen werden häufig mit 10% fetalem Rinderserum von Thermo Fisher aufrechterhalten .
GE Healthcare Myclone FBS ist weit verbreitet. De Cecco M et al verwendeten es bei 15%, um die seneszierenden Fibroblasten LF1, IMR-90 und WI-38 in den F-10-Medien von Ham aufrechtzuerhalten ., Nicetto D et al verwendeten Hyklon FBS (SH30071), um die Trypsinverdauung zu beenden und embryonale Zellen aufrechtzuerhalten . Laflamme C et al pflegten HEK-293-Zellen in DMEM High-Glucose von GE Healthcare (SH30081.01), die 10% Rinderkalb-Serum von GE Healthcare (SH30072.03) enthielten .
Frohner IE et al. Neuro-2a (N2a) und Cos-7 Zellen aus amerikanischer Typenkultursammlung in DMEM mit 10% FBS aus Bovogen, Frankreich . Laflamme C et al kultivierte U2OS-Zellen in DMEM High-Glucose, die 10% tetracyclinfreies fetales Rinderserum von Wisent enthalten (081150). Dong JX et al pflegten primäre Hippocampus-Kulturen auf Matrigel von Corning mit 5% fetalem Rinderserum von Atlanta Biologicals (S11550) ., Lee A et al kultivierte murine C2C12-Myoblasten mit DMEM, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum von VWR (89510-186) . Zhao N et al kultivierten U2OS-Zellen aus ATCC (HTB-96) in DMEM-Medium mit 10% (v/v) fetalem Rinderserum aus Altas Biologicals . Liu X et al kultivierte murine 4T1-Zellen in dmemsupplementiert mit 10% fetalem Rinderserum aus Biochrom .