migration différentielle des Holo-et APO-métalloprotéines par MICS – BN-PAGE
a été observé dans 1d natif conventionnel (CBB G-250 libre)-page (Fig. 1a) et FDS-PAGE (fig., 1B), fait intéressant, nous avons constaté que holo-et apo-Tf sont complètement séparés au moyen de MICS-BN-PAGE (Fig. 1c) (il convient de noter que deux bandes ont été observées pour un échantillon apo-Tf » pur » utilisant BN-PAGE sans mode MICS en raison de la contamination par des ions métalliques; fig. supplémentaire. S1). Dans SDS-PAGE, cela est probablement dû à la dissociation des ions métalliques des holo-formes survenant dans de fortes conditions dénaturant14,15 (données non présentées). Ce fait suggère que la reconnaissance électrophorétique entre holo-et apo-formes n’est pas disponible pour les méthodes de PAGE conventionnelles., Ces résultats impliquent que des agents dénaturants faibles spécifiques, comme CBB-G 250 employés dans MICS-BN-PAGE, reconnaissent la différence entre les Holo-et les APO-métalloprotéines pour améliorer la séparation, en plus d’éviter la dissociation des métaux.
différents comportements de migration pour les formes holo et apo ont également été observés pour la céruloplasmine (Cp) liée à Cu2+ (Cu – Cp) et la superoxyde dismutase (SOD) liée à Cu2+ et Zn2+ (Cu/Zn-SOD) par la méthode MICS-BN-PAGE (Fig. 1d, e). Les formes Apo ont migré vers des positions en correspondance étroite avec leurs poids moléculaires précis dans MICS-BN-PAGE (Fig., 1: Tf, 77 kDa; Cp, 134 kDa; SOD, 32 kDa), ce qui est utile lors de l’identification des protéines. Comme décrit dans la section Introduction, Ces résultats nous ont amenés à développer la méthode de conversion holo/apo (HAC)-2D MICS-BN-PAGE pour l’isolement sélectif des holo-métalloprotéines.
Concept de conversion holo/apo 2D MICS-BN-PAGE
notre nouvelle méthode de PAGE 2D basée sur la migration différentielle entre Holo-et APO-métalloprotéines, commence par une étape MICS-BN-PAGE réalisée en deux Voies (Voies A et B sur la Fig., 2, Panneau I) pour permettre la séparation des Holo – et apo-métalloprotéines à partir d’un échantillon contenant les deux formes de métalloprotéines. Les deux voies sont ensuite soumises à deux traitements différents après la séparation initiale MICS-BN-PAGE: la voie A est soumise à une deuxième étape MICS-BN-PAGE mais seulement après avoir subi un traitement de conversion holo/apo (Fig. 2 Panneau II-1); tandis que la voie B est livrée à un étage de page de détection de métaux pour déterminer les ions métalliques associés aux protéines séparées (Fig. 2 Groupe II-2). Le traitement appliqué à la voie B a été préalablement validé., Par exemple, la détermination de certains ions de métaux lourds (Cu2+, Fe3+, Co3+, Ni2+, Mn2+ et Cd2+) dans des échantillons de petit volume (µL) à des niveaux ppt et sub-ppb par cette méthode de PAGE sans l’utilisation d’une salle blanche a été signalée21. De plus, cette méthodologie tandem 1D MICS-BN-page/metal detection PAGE a révélé la distribution précise de Cu2+ dans le sérum humain, même pour le Cu2+ 21 faiblement lié à l’albumine (échangeable), et a suggéré que la protéine périplasmique Rubrivivax gelatinosus CopI hautement impliquée dans la résistance au cuivre est une protéine se liant au cuivre22., Néanmoins, il est difficile d’identifier complètement les protéines liées aux métaux dans un échantillon de protéines complexes en raison de la co-migration des protéines. Par exemple, il n’a pas été entièrement prouvé que CopI est une protéine de liaison au cuivre chez R. gelatinosus, bien que sa séquence ait trois sites de liaison au Cu: (i) un centre de cuivre de type 1 présent dans de nombreuses cupredoxines telles que l’azurine et la plastocyanine, (ii) une séquence N-terminus riche en Histidine et (iii) une séquence riche en histidine/méthionine. Les protéines liées à la CopI sont présentes dans de nombreuses bactéries mais ne sont pas largement conservées; par exemple, elles sont absentes d’Escherichia coli22., Jusqu’à présent,seules les protéines de R. gelatinosus et Vibrio cholerae ont été étudiées et sont impliquées dans la résistance au Cu22, 23. Chez R. gelatinosus, la protéine CopI est fortement exprimée en présence de Cu2+; cependant, le mécanisme de désintoxication du Cu est encore inconnu. Ainsi, une méthode d’isolement des métalloprotéines de toutes les autres protéines coexistant dans des échantillons biologiques complexes est nécessaire.
le Concept de HAC-2D MICROS-BN-PAGE/métal PAGE de détection de la méthode., Panneau I: Micros 1D-BN-PAGE à deux voies. La voie A a été soumise à la procédure de conversion holo/apo en gel (comme dans le Panneau II-1), puis la voie a a été soumise à une page MICS-BN-2D après la conversion holo/apo (comme dans le Panneau III). La voie B a été soumise à la page de détection Cu2+ et Fe3+ (comme dans le Panneau II-2). L’électrophérogramme 2D concerne un mélange de métalloprotéines (holo-Tf, apo-Tf, holo-Cp et holo-SOD), dans lequel les holo-métalloprotéines de l’échantillon original ont été isolées sous forme de taches sur la ligne diagonale (la ligne jaune pointillée dans le Panneau III). Versions grandeur nature des électrophérogrammes représentés sur la Fig., 2 sont représentées dans la Fig. S2.
pour surmonter cette limitation, les informations fournies par L’analyse 1D MICS-BN-PAGE/metal detection PAGE de la voie B sont augmentées en soumettant la voie A à une seconde dimension de MICS-BN-PAGE après conversion holo / apo. Pour effectuer cette analyse, la voie A est d’abord trempée dans une solution de chélateur métallique acide (voir la section Méthodes et les conditions détaillées supplémentaires) pour la conversion holo/apo (Fig. 2 Groupe II-1)., Ce faisant, les holo-métalloprotéines sont dérivées en apo-métalloprotéines sans métal dans le gel de la première dimension de PAGE. La voie a traitée est ensuite livrée à la deuxième étape MICS-BN-PAGE à l’aide d’un gel d’agarose sans métal (voir Informations supplémentaires). Dans la deuxième étape MICS-BN-PAGE (Fig. 2, Panneau III), les APO-métalloprotéines et les non-métalloprotéines de l’échantillon original migrent sur la ligne diagonale, puisque la migration de ces espèces dans la dimension de la deuxième page est complètement identique à leur migration dans la dimension de la première PAGE., D’autre part, les Holo-métalloprotéines de l’échantillon original migrent à différentes distances dans les première et deuxième dimensions MICS-BN-PAGE, puisque ces protéines migrent sous forme d’holo-formes dans la première dimension et sous forme d’apo-formes dans la deuxième dimension (et puisque MICS-BN-PAGE entraîne une mobilité électrophorétique différente pour les Holo – et APO-formes de métalloprotéines; vide infra). Ainsi, seules les Holo-métalloprotéines de l’échantillon d’origine migrent hors de la ligne diagonale dans la deuxième dimension, pour être identifiées par MALDI-TOF MS sans aucune purification protéique supplémentaire., Les types et les quantités d’ions métalliques liés aux métalloprotéines dans la solution d’échantillon originale (ceux Isolés sous forme de taches hors diagonale) peuvent être déterminés par la PAGE de détection de métaux de la voie B, comme décrit ci-dessus. Par conséquent, les informations relatives à l’identification et à la distribution des espèces de métalloprotéines, ainsi que les identités et les concentrations des ions métalliques qu’elles lient, sont accessibles à partir de cette nouvelle méthodologie HAC-2D MICS-BN-page/metal detection page.,
isolement sélectif des métalloprotéines dans HAC-2D MICS-BN-PAGE
Pour preuve de concept, HAC-2D MICS-BN-page/metal detection PAGE a été démontré pour un mélange d’échantillons contenant des étalons de protéines holo-Tf, apo-Tf, holo-Cp et holo-SOD (résultant en l’électrophérogramme 2D de la Fig. 2, Panneau III), ainsi que pour un échantillon de sérum humain (fig. S3). Des taches d’holo-métalloprotéines qui ont migré hors de la ligne diagonale ont été observées avec succès pour l’échantillon de protéines mixtes., De plus, Fe3 + a été détecté à la position de holo-Tf, et Cu2+ aux positions de holo-Cp et holo-SOD, dans la première étape MICS-BN-PAGE en utilisant metal detection PAGE. Si aucune conversion holo / apo n’est effectuée, toutes les protéines migrent sur la ligne diagonale (fig. supplémentaire. S5). Pour un échantillon de sérum humain, holo-Tf et holo-Cp ont été détectés avec succès (fig. S3)., Ainsi, il a été conclu que HAC-2D MICS-BN-PAGE / metal detection PAGE est très efficace pour l’isolement des holo-métalloprotéines et l’identification des ions métalliques initialement liés aux métalloprotéines dans un mélange de protéines.
enfin, la méthode HAC-2D MICS-BN-PAGE a été appliquée à une fraction protéique soluble bactérienne totale obtenue à partir de cellules de R. gelatinosus cultivées en présence de 1,2 mm Cu2+, exprimant la protéine CopI. Cela représente un échantillon de protéine biologique., Pour cet échantillon, une tache de la ligne diagonale a été trouvée à la position de 100 kDa et 29 kDa dans la première et la deuxième PAGE, respectivement (fig. 3a). Une forte concentration de Cu2 + a été observée à la position de 97-139 kDa dans la première MICS-BN-PAGE (Fig. 3b). Par conséquent, il a été conclu que la protéine à cet endroit a l’ion Cu lié à elle. La tache a été coupée puis analysée par MALDI-TOF MS. des Peptides correspondant à CopI ont été identifiés (Fig. 3c, Complémentaire Fig. S7 et tableau S1)., De plus, lorsque ce point de gel a été exécuté sur SDS-PAGE, une seule bande de protéine CopI a été observée (données non présentées). Une autre tache hors de la ligne diagonale a été observée à environ 40 kDa (au-dessus de la tache CopI de 29 kDa dans la deuxième dimension (fig. 3a)). Il a été confirmé par MALDI-TOF MS que cette tache provenait également de CopI (et était probablement un dimère de CopI selon le poids moléculaire). Ainsi, une métalloprotéine pourrait être spécifiquement isolée d’un mélange de protéines complexes tout en identifiant son métal lié., Cette analyse par HAC-2D MICS-BN-PAGE a définitivement prouvé que CopI est une protéine de liaison au cuivre, et fait intéressant, que cette propriété pourrait être liée à la fonction cu-détoxifiante de la protéine dans le périplasme bactérien. Une analyse quantitative plus poussée a révélé la stœchiométrie de l’ion Cu En CopI en tant que 1: 1 (basée sur les concentrations de l’ion cu lié (1,05 µM) et de la protéine holo-CopI (0,95 µM) déterminées par la coloration CBB R-250). Ceci est en accord total avec d’autres résultats expérimentaux, qui ont trouvé une stœchiométrie Cu:CopI de 1: 1.2 en utilisant ICP-MS avec CopI pur (Durand et al.,, données non publiées). Ce résultat suggère que notre méthode est également utile pour l’étude des stœchiométries des métalloprotéines.
HAC-2D MICS-BN-PAGE employant la coloration à l’argent (a), avec la page de détection Cu2+ (b), d’une fraction soluble obtenue à partir de R. cellules gélatineuses cultivées en présence de 1,2 mm CU2+ (protéine totale: 31,5 µg). Le point hors diagonale indiqué par l’astérisque en (a)a été soumis à MALDI-TOF MS (fig., S7), identifiant les séquences indiquées en police rouge dans le cadre de la séquence CopI mature (c). Versions grandeur nature des électrophérogrammes représentés sur la Fig. 3 sont illustrés à la figure Supplémentaire. S8.
expériences D’électrophorèse capillaire pour étudier les modes de reconnaissance moléculaire
l’amélioration de la résolution entre les formes holo – et apo-dans les micros-PAGE assistée par le colorant CBB (Fig., 1c-e) est une clé importante de notre méthodologie, et, fait intéressant, cette reconnaissance moléculaire semble provenir de différents nombres de molécules de colorant CBB G-250 se liant à chacune des formes holo – vs. apo-des métalloprotéines. Ceci, à son tour, se traduit probablement par différentes charges efficaces, et / ou structures stériques induites, pour les complexes colorant-protéine. Ces deux effets auraient un impact sur la mobilité électrophorétique., Pour obtenir des informations plus approfondies sur le mécanisme de reconnaissance de la liaison du colorant CBB G-250 vers holo – et apo-Tf, des expériences CE ont été menées, ainsi que des simulations d’amarrage à l’aide du programme Autodock Vina24,25 (vide infra). Le CZE est effectué en solution aqueuse libre sans matrice de gel, et il n’est donc pas nécessaire de prendre en compte un effet de tamisage moléculaire dans les simulations. La mobilité électrophorétique de l’holo-Tf mesurée par CZE était évidemment différente de celle de l’apo-Tf Avec l’ajout du colorant CBB (Fig. 4), alors que ces protéines avaient des mobilités identiques en l’absence du colorant., Ce fait suggère fortement que le nombre de molécules de colorant liées aux Holo – et apo-métalloprotéines est différent. Dans CZE, la migration du complexe protéine-colorant serait principalement affectée par la charge effective du complexe, qui, à son tour, serait affectée par le nombre de molécules de colorant CBB anionique à charge unique liées à la protéine.,
électrophérogrammes typiques des expériences CZE pour: 10 µM holo – ou apo-Tf sans CBB G-250 (trace verte supérieure); et mélanges contenant 5 mm de colorant CBB g-250 avec 10 µm Holo-TF (trace bleue moyenne) ou avec 10 µm APO-TF (trace rouge inférieure).,
traditionnellement, la mobilité électrophorétique d’une protéine en solution libre est représentée par L’équation de Henry, comme le montre l’équation (1):
ici, q, η, R et K représentent la charge nette, la viscosité de la solution, le rayon de la protéine et la longueur de Debye inverse de la solution électrolytique. La fonction Henry, H, augmente de manière monotone de 2/3 à 1., Strictement parlant, cette formule s’applique exclusivement à une molécule sphérique avec une distribution de charge centrosymétrique, bien qu’il y ait quelques discussions pour modifier L’équation de Henry pour s’appliquer aux protéines non sphériques avec une distribution de charge complexe (y compris dipôle et quadripôle)26. Dans notre cas, les molécules holo – et apo-Tf sont des sphères déformées de taille très similaire (ressemblant à des sphéroïdes avec des longueurs d’axe long et court d’environ 92 et 60 Å (holo-Tf), et 93 et 68 Å (apo-Tf), respectivement) (fig. supplémentaire. S9)., De plus, on s’attend à ce que le dipôle et le quadripôle n’aient qu’un effet mineur sur la mobilité puisque les molécules CBB G-250 liées à holo-/apo-Tf ne sont pas localisées, comme le montre la figure supplémentaire. S9 (voir ci-dessous). Les résultats de calculs précis de Kim et al.26 montrent que la mobilité électrophorétique d’une protéine sphéroïdale n’est pas significativement affectée par un quadripôle dans des solutions de faible résistance ionique (I < 0,01 M), et la résistance ionique du tampon de séparation dans nos expériences CZE était également faible (i = 0,013 M).,
ainsi, le rapport des mobilités électrophorétiques de l’apo – et de l’holo-Tf complexés avec le colorant CBB G-250 (à savoir, µApo/µHolo), est attribué au rapport des charges nettes de chaque complexe (à savoir, QApo / QHolo), qui peut être facilement dérivé de L’équation de Henry. Les charges nettes négatives des complexes Tf-CBB G-250 proviennent principalement du nombre de liaison du colorant. Par conséquent, la valeur de µApo / µHolo donne également le rapport des nombres de colorants (à savoir, NApo/NHolo). Expérimentalement, le rapport des mobilités électrophorétiques des deux formes de Tf (µApo / µHolo = (-2.69 × 10-4)/(-2.,09 × 10-4)) a été trouvé à 1,29 Par CZE (Fig. 4), ce qui correspond au rapport de charge électrique effective, à condition que les tailles des deux formes de Tf soient similaires. Par conséquent, le rapport des mobilités électrophorétiques devrait être en accord avec le rapport des molécules de colorant liées. Cependant, une discussion plus approfondie de la relation entre la mobilité électrophorétique et la forme des protéines pour d’autres métalloprotéines est nécessaire dans les cas où les formes holo – et apo-protéiques diffèrent (comme pour Cp).,
expériences de simulation D’amarrage moléculaire pour étudier les modes de reconnaissance moléculaire
La liaison de colorant a été déterminée par des simulations d’amarrage moléculaire flexibles par AutoDock Vina27, conçues pour rechercher de manière exhaustive des sites de liaison et calculer leurs énergies libres (Fig. 5 et fig. supplémentaire. S9). Récemment, Wang et coll.25 a signalé Qu’AutoDock Vina a une puissance de notation élevée et une puissance d’échantillonnage intermédiaire par rapport à d’autres programmes d’amarrage largement utilisés., Selon ces simulations, un plus grand nombre de molécules de colorant CBB G-250 liées à des sites de liaison Fe vacants dans apo-Tf par rapport à holo-Tf (Fig. 5a) ont été observés. Sur la base de ces simulations Autodock Vina, le rapport du nombre de liaison au colorant NApo / NHolo s’est avéré être de 1,23, avec une énergie de liaison <-6,5 kcal/mol (correspondant à K~104,4 M−1) (Fig. 5B pour la distribution de fréquence cumulative du nombre de liaison au colorant en fonction de l’énergie de liaison), qui est en bon accord avec nos résultats CZE, discutés précédemment (NApo/NHolo = 1.29)., La liaison Quantitative est présumée avec l’ajout du colorant à des niveaux mM (plus de 95% des sites de liaison interagissent avec le colorant lorsque log K est 4,4 ou plus), comme dans ces expériences.
le nombre de liaison des molécules de colorant avec holo-Tf a également été étudié par des expériences CZE (données non présentées), comme jugé à partir de la diminution du pic de colorant libre pour un échantillon de colorant CBB G-250 de 1 mM avec et sans addition de 10 µM holo-Tf., Étant donné que le nombre de liaison a été mesuré comme étant >18, le nombre de liaison de NHolo a été présumé être > 20 dans les expériences MICS-BN-PAGE (avec un colorant de 3,0 mM ajouté). Ce nombre de liaison de molécules de colorant (>20) des expériences CZE est en bon accord avec le nombre de molécules de colorant liées (N = 21) des simulations d’amarrage moléculaire qui donneraient lieu à l’affinité prévue de -6,5 kcal/mol, et nos résultats sont donc Auto-cohérents.,
Il ressort de ces simulations d’amarrage moléculaire et des expériences CZE que le colorant CBB G-250 reconnaît les différentes structures chimiques des Holo – et apo-métalloprotéines pour donner différentes valeurs µ. Des observations plus détaillées des modes de liaison simulés suggèrent également que la molécule CBB G-250 interagit avec les résidus d’acides aminés accessibles en raison de la structure apo-Tf plus ouverte (dépliée) par rapport à la structure holo-Tf plus fermée (pliée), tandis que le colorant ne montre aucune liaison directe avec les résidus D’acides aminés de liaison Fe (Asp392, Tyr429, Tyr517 et His 585)., Ainsi, il est implicite que le colorant reconnaît de petites différences entre les structures chimiques pliées et dépliées des métalloprotéines, qui sont induites par la liaison ou la dissociation des ions métalliques. Ces petites différences ne peuvent être identifiées par aucune autre méthode de séparation conventionnelle.
résidus d’acides aminés en contact avec la molécule de colorant dans chaque site de liaison au colorant dans la simulation (par exemple, fig. S10) ont été classés en fonction de leur nature dominante: charge hydrophobe, hydrophile ou électrostatique (résumée dans les tableaux supplémentaires S2 et S3)., Selon les résultats, les populations de chaque type d’acide aminé interagissant avec les molécules de colorant n’ont montré aucune différence entre les formes holo – et apo-protéiques (26-27% pour hydrophobe, 37-40% pour hydrophile, 33-35% pour les résidus chargés sous chaque forme). Cependant, le nombre de liaisons hydrogène dans l’apo-Tf (33 au total; 1,2 par site de liaison) était significativement plus important que dans l’holo-Tf (19 au total; 0,9 par site de liaison). En se concentrant sur les huit sites de liaison dans l’apo-Tf qui n’étaient pas présents dans l’holo-Tf (tableau supplémentaire S3), le nombre de liaisons H par site a été trouvé à 2,1., Ces résultats suggèrent fortement que les changements dans les interactions des liaisons hydrogène sont principalement responsables de la différenciation entre les formes holo – et apo-Tf, alors qu’une étude plus approfondie serait nécessaire pour comprendre le mécanisme complet.