le gène de l’ARNr 16S est utilisé pour des études phylogénétiques car il est hautement conservé entre différentes espèces de bactéries et d’archées. Carl Woese (1977) a été le pionnier de cette utilisation de l’ARNr 16S. Il est suggéré que le gène de l’ARNr 16S peut être utilisé comme une horloge moléculaire fiable parce que les séquences d’ARNr 16S de lignées bactériennes distantes ont des fonctionnalités similaires. Certaines archées thermophiles (par exemple, l’ordre des Thermoprotéales) contiennent des introns du gène de l’ARNr 16S qui sont situés dans des régions hautement conservées et peuvent avoir un impact sur le recuit des amorces « universelles »., Les ARNr mitochondriaux et chloroplastiques sont également amplifiés.
la paire d’amorces la plus courante a été conçue par Weisburg et al. (1991) et est actuellement appelé 27F et 1492R; cependant, pour certaines applications, des amplicons plus courts peuvent être nécessaires, par exemple pour le séquençage 454 avec la chimie du titane, la paire d’amorces 27F-534r couvrant V1 à V3.Souvent, 8F est utilisé plutôt que 27F. les deux amorces sont presque identiques, mais 27F a un M au lieu d’un C. AGAGTTTGATCMTGGCTCAG par rapport à 8F.,
| Apprêt nom | Séquence (5′-3′) | Réf.,td> | |
|---|---|---|---|
| 805R | GAC TAC CAG GGT ATC TAA TC | ||
| 533F | GTG CCA GCM GCC GCG GTA A | ||
| 518R | GTA TTA CCG CGG CTG CTG G | ||
| 1492R | CGG TTA CCT TGT TAC GAC TT |
PCR and NGS applicationsEdit
In addition to highly conserved primer binding sites, 16S rRNA gene sequences contain hypervariable regions that can provide species-specific signature sequences useful for identification of bacteria.,En conséquence, le séquençage du gène de l’ARNr 16S est devenu répandu en microbiologie médicale en tant qu’alternative rapide et bon marché aux méthodes phénotypiques d’identification bactérienne. Bien qu’il ait été utilisé à l’origine pour identifier les bactéries, le séquençage 16S s’est avéré par la suite capable de reclasser les bactéries en espèces complètement nouvelles, voire genera.It a également été utilisé pour décrire de nouvelles espèces qui n’ont jamais été cultivées avec succès.,Avec l’arrivée du séquençage de troisième génération dans de nombreux laboratoires, l’identification simultanée de milliers de séquences d’ARNr 16S est possible en quelques heures, ce qui permet des études métagénomiques, par exemple de la flore intestinale.
régions Hypervariablesmodifier
le gène bactérien 16S contient neuf régions hypervariables (V1–V9), d’une longueur d’environ 30 à 100 paires de bases, qui sont impliquées dans la structure secondaire de la petite sous-unité ribosomique., Le degré de conservation varie considérablement entre les régions hypervariables, les régions plus conservées étant corrélées à la taxonomie de niveau supérieur et les régions moins conservées à des niveaux inférieurs, tels que le genre et les espèces. Alors que l’ensemble de la séquence 16S permet de comparer toutes les régions hypervariables, à environ 1 500 paires de bases de long, il peut être prohibitif pour les études cherchant à identifier ou caractériser diverses communautés bactériennes., Ces études utilisent généralement la plate-forme Illumina, qui produit des lectures à des taux 50 fois et 12 000 fois moins coûteux que le pyroséquençage 454 et le séquençage Sanger, respectivement. Bien que moins cher et permettant une couverture communautaire plus approfondie, le séquençage Illumina ne produit que des lectures de 75 à 250 paires de bases (jusqu’à 300 paires de bases avec Illumina MiSeq), et n’a pas de protocole établi pour assembler de manière fiable le gène complet dans des échantillons communautaires. Cependant, des régions hypervariables complètes peuvent être assemblées à partir d’une seule exécution Illumina, ce qui en fait des cibles idéales pour la plate-forme.,
alors que les régions hypervariables 16S peuvent varier considérablement entre les bactéries, le gène 16S dans son ensemble maintient une plus grande homogénéité de longueur que son homologue eucaryote (ARN ribosomique 18S), ce qui peut faciliter les alignements. De plus, le gène 16S contient des séquences hautement conservées entre des régions hypervariables, permettant la conception d’amorces universelles capables de produire de manière fiable les mêmes sections de la séquence 16S à travers différents taxons. Bien qu’aucune région hypervariable ne puisse classer avec précision toutes les bactéries du domaine à l’espèce, certaines peuvent prédire de manière fiable des niveaux taxonomiques spécifiques., De nombreuses études communautaires sélectionnent des régions hypervariables semi-conservées comme le V4 pour cette raison, car il peut fournir une résolution au niveau du phylum aussi précisément que le gène 16S complet. Alors que les régions moins conservées ont du mal à classer de nouvelles espèces lorsque la taxonomie d’ordre supérieur est inconnue, elles sont souvent utilisées pour détecter la présence d’agents pathogènes spécifiques. Dans une étude de Chakravorty et al. en 2007, les auteurs ont caractérisé les régions V1–V8 d’une variété d’agents pathogènes afin de déterminer quelles régions hypervariables seraient les plus utiles à inclure pour des essais spécifiques à la maladie et à grande échelle., Entre autres résultats, ils ont noté que la région V3 était la meilleure pour identifier le genre pour tous les agents pathogènes testés, et que V6 était la plus précise pour différencier les espèces entre tous les agents pathogènes contrôlés par les CDC testés, y compris l’anthrax.
bien que l’analyse de la région hypervariable 16S soit un outil puissant pour les études taxonomiques bactériennes, elle peine à différencier les espèces étroitement apparentées. Dans les familles Enterobacteriaceae, Clostridiaceae et Peptostreptococcaceae, les espèces peuvent partager jusqu’à 99% de similitude de séquence sur l’ensemble du gène 16S., En conséquence, les séquences V4 ne peuvent différer que de quelques nucléotides, ce qui empêche les bases de données de référence de classer de manière fiable ces bactéries à des niveaux taxonomiques inférieurs. En limitant l’analyse 16S à certaines régions hypervariables, ces études peuvent ne pas observer les différences dans les taxons étroitement apparentés et les regrouper en unités taxonomiques uniques, ce qui sous-estime la diversité totale de l’échantillon. En outre, les génomes bactériens peuvent abriter plusieurs gènes 16S, les régions V1, V2 et V6 contenant la plus grande diversité intraspécifique., Bien que ce ne soit pas la méthode la plus précise de classification des espèces bactériennes, l’analyse des régions hypervariables reste l’un des outils les plus utiles disponibles pour les études sur les communautés bactériennes.