la technique de base pour la détection des RFLP consiste à fragmenter un échantillon d’ADN avec l’application d’une enzyme de restriction, qui peut cliver sélectivement une molécule D’ADN partout où une courte séquence spécifique est reconnue dans un processus connu sous le nom de digest de restriction. Les fragments D’ADN produits par le digest sont ensuite séparés par la longueur par un processus connu sous le nom d’électrophorèse sur gel d’agarose et transférés à une membrane via la procédure Southern blot., L’hybridation de la membrane à une sonde d’ADN marquée détermine alors la longueur des fragments qui sont complémentaires à la sonde. On dit qu’un polymorphisme de longueur de fragment de restriction se produit lorsque la longueur d’un fragment détecté varie entre les individus, indiquant des homologies de séquence non identiques. Chaque longueur de fragment est considérée comme un allèle, qu’elle contienne ou non une région codante, et peut être utilisée dans une analyse génétique ultérieure.,
Schéma pour RFLP par le site de clivage de la perte
Analyse et à l’héritage de alléliques RFLP fragments (NIH)
Schéma pour RFLP par VNTR variation de longueur
ExamplesEdit
Il existe deux mécanismes par lesquels la taille d’un fragment de restriction peuvent varier. Dans le premier schéma, un petit segment du génome est détecté par une sonde D’ADN (ligne plus épaisse)., Dans l’allèle A, le génome est clivé par une enzyme de restriction à trois sites voisins (triangles), mais seul le fragment le plus à droite sera détecté par la sonde. Dans l’allèle a, le site de restriction 2 a été perdu par une mutation, de sorte que la sonde détecte maintenant le plus grand fragment fusionné courant des sites 1 à 3. Le deuxième diagramme montre comment cette variation de taille de fragment ressemblerait à une tache Méridionale, et comment chaque allèle (deux par individu) pourrait être hérité dans les membres d’une famille.,
dans le troisième schéma, la sonde et l’enzyme de restriction sont choisies pour détecter une région du génome qui comprend un segment de répétition en tandem à nombre variable (VNTR) (boîtes dans le diagramme schématique). Dans l’allèle c, il y a cinq répétitions dans le VNTR, et la sonde détecte un fragment plus long entre les deux sites de restriction. Dans l’allèle d, il n’y a que deux répétitions dans le VNTR, de sorte que la sonde détecte un fragment plus court entre les deux mêmes sites de restriction. D’autres processus génétiques, tels que les insertions, les délétions, les translocations et les inversions, peuvent également conduire à des polymorphismes., Les tests RFLP nécessitent des échantillons d’ADN beaucoup plus importants que les tests à répétition tandem courte (STR).