rapports D’oncologie

Introduction

Les espèces réactives de l’oxygène (ROS) sont des molécules hautement instables et réactives contenant des fractions d’oxygène. Ils comprennentle peroxyde d’hydrogène(H2O2), l’anion superoxyde (O2●−) et le radical hydroxyle (●OH).Bien que les ROS soient reconnus comme des agents cytotoxiques, ils peuvent servir de second messagers pour contrôler de nombreux événements cellulaires d’expression génétique, de différenciation, de prolifération cellulaire et de mort cellulaire(1,2)., Les ROS sont générés en continu par un métabolisme aérobie endogène dans les cellules sous la forme de theo2●− et/ou sont délibérément fabriqués par des oxydases,telles que la nicotinamide adénine dinucléotide phosphate (NADPH) oxydase et la xanthine oxydase (3).O2● – est converti enh2o2 par l’enzyme superoxyde dismutase (4). Le H2O2 est ensuite transformé en O2 et en H2O par les catalaséou les glutathion peroxydases (5).Comparé à d’autres membres de ROS, non-radicalH2O2 est capable de pénétrer librement cellmembranes, et il interagit avec le fer ferreux (chimie de Fenton),qui produit le très destructeur et de courte durée●OH., La production de différentes formes de ROS à diversniveaux peuvent être utiles ou nocifs pour les cellules et les tissus.En particulier, des quantités excessives de ROS peuvent être le résultat de leur surproduction et/ou de leur régulation à la baisse des antioxydants.Des niveaux accrus de ROS peuvent entraîner des dommages à L’ADN, aux protéines et aux lipides dans les cellules, les impliquant dans l’étiologie de plusieurs maladies humaines, y compris le cancer (6-9).

l’apoptose est une mort cellulaire programmée et se produit par deux voies différentes: la voie intrinsèque mitochondriale et la voie extrinsèque médiée par les récepteurs (10)., L’étape clé de l’apoptose médiée par lemitochondrial est la translocation du cytochromec des mitochondries au cytosol et son interaction subséquente avec L’Apaf-1 et la caspase-9 pour former un complexe(apoptosome). L’apoptosome active en outre la caspase exécutive-3, -6 et -7 (11). Inversement, la voie extrinique commence par la liaison de ligands spécifiques, tels que TNF-α, TRAIL et Fas aux récepteurs de mort cellulaire respectifs,qui stimulent les activités de la caspase-8 et -3 (12)., La Caspase-8 Clive BID, protéine cytosolique apro-apoptotique de la famille Bcl – 2, pour générer un produit tronqué, le tBID qui pénètre dans les mitochondries et diminue le potentiel de membrane mitochondriale (MMP;ΔΨm), provoquant la libération du cytochrome C. la translocation d’une autre protéine apoptotique, Bax du cytosol vers les mitochondries déclenche également une perte similaire de MMP La Caspase-3 est la caspase exécutive clé; sonactivation peut systématiquement désassembler l’intégrité des cellules à travers le clivage de plusieurs protéines clés, telles que la poly(ADP-ribose)polymérase (PARP) et le RhoGDI.,

les poumons sont sensibles à une variété de blessures aéroportées et d’origine sanguine qui peuvent par conséquent causer une fibrose pulmonaire et un cancer (13). La carcinogenèse du cancer du poumon est considérée comme étroitement liée àl’inflammation tissulaire médiée par H2O2. Au cours de l’inflammation, on s’attend à ce que les concentrations tissulaires de H2O2 atteignent des niveaux presque millimolaires, tandis que les niveaux inférieurs de H2O2 produits par les oxydas de NADPH dans des conditions normales ne présentent pas un effet plus élevé que le microenvironnement de la membrane plasmique, tel que les vaisseaux lipidiques (14,15)., Néanmoins,dans les deux cas, H2O2 peut moduler les fonctions cellulaires vitales de la prolifération cellulaire, de la mort et de la différenciation en modifiant les niveaux de signalisation et l’expression génique et ses niveaux plus élevés peuvent entraîner une opoptose et/ou une nécrose. Le H2O2 exogène est fréquemment utilisé comme ROS représentatif pour simuler la pression oxydative dans les cellules et les tissus. H2O2 estrelativement non toxique pour les cellules normales des cellules veinendothéliales ombilicales humaines et des cellules musculaires lisses de l’artère pulmonaire humaine(16,17). La mort cellulaire déclenchée par H2O2 dans les cellules cancéreuses du poumon peut avoir un intérêt pour la recherche cytotoxicologique.,

dans la présente étude, les effets moléculaires du H2O2 exogène sur les cellules du cancer du poumon Calu-6 et A549 ont été évalués en ce qui concerne la croissance et la mort cellulaires, de même que les effets anti-apoptotiques de divers inhibiteurs de la caspase ont été examinés dans les cellules du cancer du poumon traitées par H2O2.,

matériaux et méthodes

culture cellulaire

les lignées cellulaires Calu-6 et A549 du cancer du poumon humain ont été achetées à la Korean Cell Line Bank (Séoul, Corée) et ont été cultivées dans un milieu RPMI-1640 complété par 10% de sérum fetalbovine (FBS; Sigma-Aldrich; Merck KGaA, Darmstadt, Allemagne)et 1% de pénicilline-streptomycine (Gibco-BRL; thermo fisherscientific, Inc., Waltham, MA, USA). Ces cellules ont été régulièrement cultivées dans des boîtes de culture de tissus plastiques de 100 mm (Nunc, Roskilde,Danemark) et récoltées avec une solution de trypsine-EDTA (Gibco-BRL;Thermo Fisher Scientific, Inc.).,

réactifs

essais de croissance cellulaire et de numération cellulaire

Les changements de croissance cellulaire ont été évalués en évaluant l’absorbance des colorants par le bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2, 5-diphényltétrazolium (MTT;Sigma-Aldrich; Merck KGaA) comme décrit précédemment(19). Les nombres de cellules viables et mortes ont été déterminés par la méthode de coloration des cellules bleues trypan (20). Les cellules ont été exposées aux quantités désignées d’H2O2 avec ou sans 15 µM de chaque inhibiteur de la caspase pendant 24 h.,

analyse du cycle cellulaire et des cellules sous-G1

analyse du cycle cellulaire et des cellules sous-G1 par coloration à l’iodure de propidium (PI; Sigma-Aldrich; Merck KGaA) comme décrit précédemment (20). Les cellules ont été exposées aux quantités désignées d’H2O2 avec ou sans 15 µM de chaque caspaseinhibiteur pendant 24 h. Les distributions du cycle cellulaire ont été analysées avec le cytomètre en flux aFACStar (Becton-Dickinson and Company, FranklinLakes, NJ, USA).,

coloration de L’annexine V-FITC pour la détection de la mort cellulaire

la mort cellulaire apoptotique a été vérifiée en mesurant les cellules avec de l’isothiocyanate D’annexine V-fluorescéine (FITC;Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.) comme décrit précédemment (20). Les cellules ont été exposées à des quantités désignées de H2O2 avec ou sans 15µm de chaque inhibiteur de caspase pendant 24 h. La coloration de L’annexine V-FITC a été analysée avec un cytomètre en flux FACStar (Becton-Dickinson andCompany).,

évaluation du MMP(ΔΨm)

Le MMP (ΔΨm) a été évalué par un colorant fluorescent rhodamine123 (Sigma-Aldrich; Merck KGaA) comme décrit précédemment (21). Les cellules ont été exposées aux quantités désignées de H2O2 avec ou sans 15 µM de chaque inhibiteur de la caspase pendant 24 h. L’intensité de coloration de la Rhodamine 123 a été analysée par un cytomètre en flux FACStar(Becton-Dickinson and Company). L’absence de rhodamine 123 dans les cellules a indiqué la perte de MMP (ΔΨm) dans les cellules du cancer du poumon., Les niveaux de MMP (ΔΨm) dans les cellules ne comprenant pas les cellules de perte de MMP(ΔΨm) ont été exprimés sous la forme de l’intensité moyenne de fluorescence, qui a été estimée par le logiciel CellQuest (version 5.1;Becton-Dickinson and Company).

analyse Western blot

Les changements dans les cellules traitées par Bcl-2, caspase-3 et PARP inH2O2 ont été analysés par westernblotting. En bref, 1×106 cellules dans un plat de culture de 60 mm(Nunc) ont été incubées avec les quantités désignées d’H2O2 pendant 24 h. Les échantillons contenant 20 µg de protéines totales ont été séparés par 8 ou 12. ,5% de gel SDS-PAGE, transféré aux membranes toImmobilon-P PVDF (EMD Millipore, Billerica, MA, USA) byelectrobloting puis sondé avec des anticorps anti-Bcl-2, anti-caspase-3,anti-PARP et anti-β-actine (dilution 1:5,000; Santa CruzBiotechnology, Santa Cruz, CA, USA). Les Membranes ont été traitées avecdes anticorps secondaires conjugués à la peroxydase de harséradish (dilution1: 5 000; Cell signaling Technology, Inc.). Les Blots ont été développés Pardes moyens D’un kit ECL (Amersham Life Science, Arlington Heights, IL,USA).,

Quantification des activités de la caspase-3 et −8

les activités de la caspase-3 et -8 ont été évaluées par des kits de dosage colorimétrique de la caspase-3 et -8 (R& d Systems, Inc.) comme décrit précédemment (20). Inbrief, 1×106 cellules dans une boîte de culture de 60 mm (Nunc) ont été traitées avec 75 µM H2O2 pendant 24 h. des échantillons contenant 50 µg de protéines totales ont été utilisés pour évaluer les activités de la caspase-3 et-8.

analyse statistique

Les données représentant au moins deux expériences indépendantes (moyenne ± écart-type) ont été analysées à L’aide du logiciel InStat(GraphPad Prism4; GraphPad Software, Inc.,, San Diego, CA, USA). Le test t de l’étudiant ou l’analyse unidirectionnelle de la variance (ANOVA) avec l’analyse posthoc utilisant le test de comparaison multiple de Tukey a été utilisé pour les données paramétriques. P <0,05 a été considéré comme indiquant une différence statistiquement significative.

résultats

H2O2 affecte la croissance cellulaire et la distribution du cycle dans les cellules cancéreuses du poumon

Les effets cellulaires de H2O2 sur la croissance des cellules cancéreuses du poumon ont été examinés à 24 h., Traitementavec 50-250 µM H2O2 significativement reducedviable (bleu trypan négatif) et l’augmentation des morts (trypanblue-positif) Calu-6 cellules d’une manière dose-dépendante (Fig. 1A). Sur la base des tests MTT, 50-250 µMH2O2 ont considérablement atténué la croissance des cellules Calu-6 avec un IC50 de ~50 µM (Fig. 1B). Lorsque la distribution du cycle cellulaire dans les cellules Calu-6 traitées par H2O2 a été examinée, les cellules Calu-6 traitées par H2O2 à 75 µM ont démontré un arrêt significatif de la phase G1 du cycle cellulaire par rapport aux cellules témoins (Fig.2A et B)., Comme dans Calu-6, lors du traitement par H2O2, le nombre de cellules viables A549 a diminué et les cellules mortes ont augmenté de manière significative en fonction de la dose (Fig. 1C). De plus, H2O2 a réduit de manière dose-dépendante la croissance des cellules A549 avec un IC50 de ~100 µM (Fig. 1D). Le traitement par 100 µMH2O2 a également induit de manière significative un repos de la phase G1 dans les cellules A549 par rapport aux cellules témoins (Fig. 2A et B).

H2O2 influence la mort cellulaire et les cellules cancéreuses pulmonaires traitées par MMP (ΔΨm) inH2O2

par la suite, le rôle de la mort des cellules cancéreuses pulmonaires H2O2in a été davantage étudié pour mieux comprendre., Alors que 50-100 µM H2O2 augmentaient significativement les pourcentages de cellules sous-G1 dans les cellules Calu-6, 250 µM H2O2 n’augmentaient pas le pourcentage de cellules sous-G1 dans ces cellules (Fig. 2A et C). Cependant, le traitement par50-250 µM H2O2 en fonction de la dose a augmenté le nombre de cellules colorées par L’annexine V-FITC dans les cellules Calu-6 (Fig. 3A). Lorsque l’effet de H2O2 sur MMP (δʿm) dans les cellules Calu-6 a été évalué à l’aide de rhodamine 123, H2O2 a provoqué la perte de MMP (δʿm) chez un patient dépendant de la dose (Fig. 3B)., En ce qui concerne le niveau de toMMP (ΔΨm) dans les cellules Calu-6 à l’exclusion des cellules de coloration de negativerhodamine 123, H2O2 a diminué le niveau de MMP (ΔΨm) dans les cellules Calu-6 dans un agent dose-dépendant (Fig. 3C). Dans les cellules A549, le traitement de 50 et 100 µM H2O2 a considérablement augmenté les pourcentages de cellules sous-G1, mais le traitement avec 250 et 500 µM H2O2 n’a pas montré cet effet(Fig. 2A et C).H2O2 a augmenté en fonction de la dose le nombre de cellules A549 colorées par l’anexine V-FITC (Fig.3D). En outre, H2O2 dose-dependentlyinduced la perte de MMP (ΔΨm) dans les cellules A549 (Fig. 3E)., Alors que 50 µMH2O2 ont augmenté le niveau de MMP (δʿm) dans les cellules A549, 100-250 µM H2O2 ont considérablement réduit les niveaux de MMP (δʿm) dans ces cellules (Fig. 3F).

H2O2 influence les protéines liées à l’apoptose et les caspases cellules cancéreuses pulmonaires traitées par inH2O2

L’évaluation des protéines liées à l’apoptose pendant la mort des cellules pulmonaires induite par 2O2 a révélé que Bcl-2, une protéine anti-apoptotique, diminuait le traitement par l’uponH2O2 dans les cellules Calu-6 (Fig. 4A). Le niveau de pro-caspase-3 a été réduit de 75 µM H2O2 (Fig. 4A). La forme ininterrompue du PARP de 116 kDa N’a pas été altérée par H2O2 (fig. 4A)., On a constaté que l’activité de la caspase-3 était augmentée dans les cellules Calu-6 traitées par H2O2, tandis que celle de la caspase-8 n’était pas significativement modifiée(fig. 4B). Le traitement avec 50-100 µMH2O2 semble diminuer les taux de Bcl-2,de pro-caspase-3 et de protéines PARP dans les cellules A549 (Fig. 4C). Plus précisément, 100 µMH2O2 ont montré une diminution marquée des niveauxde ces protéines. Traitement avec 75 µM H2o2augmenté significativement l’activité de la caspase – 3 dans les cellules A549 etaugmenté significativement l’activité de la caspase-8 (Fig. 4D).,

les inhibiteurs de la Caspase affectent la croissance et la mort cellulaires dans les cellules de cancer du poumon traitées par H2O2

par la suite, nous avons cherché à déchiffrer le rôle des caspases individuelles dans la mort cellulaire induite par H2O2 à 24 h dans les lignées cellulaires de carcinome pulmonaire. Les cellules Calu-6 et A549 ont été pré-incubées avec un inhibiteur de caspase de 15 µM pendant 1 h avant le traitement avec 75 ou 100 µM H2O2. Aucun des inhibiteurs de la caspase testés n’a influencé L’inhibition de la croissance induite par H2O2 dans les lignées cellulaires Calu-6 et A549(Fig. 5A et D)., Cependant, tous les inhibiteurs de la thecaspase testés dans le Calu-6 traité par H2O2 ont diminué les pourcentages de cellules sous-G1 au niveau des cellules témoins (fig. 5B). En outre, le traitement avec tous les inhibiteurs de la caspase testés a considérablement réduit le nombre de cellules de Calu-6 traitées par L’annexine V-FITC dans2o2, mais l’effet diminué a été plus faible par rapport à la diminution des cellules sous-G1(Fig. 5C). Tous les caspaseinhibiteurs ont nettement sauvé les cellules A549 de la mort cellulaire favorisée par l’H2O2, comme l’a évalué la population de cellules sous-G1 (Fig.5E)., En outre, ces inhibiteurs ont considérablement réduit le nombre de cellules A549 traitées par L’annexine V-FITC (fig. 5F). Chaque inhibiteur de la caspase a eu des effets anti-décès très similaires dans les cellules cancéreuses du poumon traitées par leh2o2.

les inhibiteurs de la Caspase affectent le MMP(δṣm) dans les cellules cancéreuses du poumon traitées par H2O2

la mort cellulaire est fortement associée à l’effondrement du MMP (δṣm) (22).Ainsi, le MMP (ΔΨm) dans les cellules cancéreuses du poumon traitées à 75 ou 100 µMH2O2 a été déterminé avec ou sans chaque inhibiteur de caspase à 24 h., Cependant, tous les inhibiteurs de la thecaspase n’ont pas réduit de manière significative la perte de MMP(ΔΨm) dans les cellules Calu-6 traitées par H2O2 (Fig. 6A). De plus, la plupart de ces inhibiteurs n’ont pas influencé le niveau de MMP (ΔΨm) dans les cellules Calu-6 traitées par H2O2. Cependant, l’inhibiteur de la caspase-9 (Z-LEHD) semble augmenter la diminution du niveau dans ces cellules (Fig. 6B). dans les cellules A549, tous les inhibiteurs de la caspase ont partiellement empêché la perte de MMP (ΔΨm) par H2O2(Fig. 6C). Les cellules A549 traitées par InH2O2, les inhibiteurs de la caspase-9, ont encore amélioré de manière sélective la diminution du niveau de MMP (ΔΨm) (Fig. 6D)., Cet inhibitoralone a significativement réduit les niveaux de MMP (ΔΨm) dans les cellules de contrôle Calu-6And A549 (Fig. 6B andD).

Discussion

le cancer du poumon représente l’une des principales causes de mortalité liée au cancer dans le monde et est lié à l’activité malveillante des ROS. Dans la présente étude, exogenousH2O2 a été utilisé pour générer un stress oxydatif dans les cellules cancéreuses du poumon. Cette étude s’est concentrée sur la définition des mécanismes moléculaires de l’inhibition de la croissance cellulaire et de la mort cellulaire dans les cellules de cancer du poumon Calu-6 et A549 traitées en 2O2., D’après les essais de MTT, après une exposition de 24 h, les valeurs IC50 pour H2O2 étaient respectivement d’environ 50 et 100 µM dans les cellules Calu-6 et A549.H2O2 a augmenté de manière dose-dépendante le nombre de cellules Calu-6 et A549 colorées en V-FITC, indiquant que la mort des cellules cancéreuses pulmonaires induite par H2O2 se produisait par apoptose. De toute évidence, H2O2 a diminué les niveaux de Bcl-2 et de pro-caspase-3 dans les deux types de cellules.La PARP a été réduite dans les cellules A549 traitées par H2O2. De plus, les activités de la caspase-3 et de la caspase -8 ont augmenté dans les deux types de cellules traitées par H2O2.L’apoptose est fortement liée à l’effondrement de MMP(ΔΨm) (22).,H2O2 a déclenché la perte de MMP (ΔΨm) dans les cellules Calu-6 et A549 dans une matrice dose-dépendante, indiquant que la mort des cellules cancéreuses du poumon parh2o2 était étroitement liée à l’effondrement de MMP (ΔΨm). En outre, H2O2 a réduit le niveau de MMP (ΔΨm) dans les cellules cancéreuses du poumon contenant le colorant rhodamine 123.

bien que 50-100 µM H2O2 augmentent significativement les pourcentages de cellules sub-G1 Calu-6 et A549, 250 ou 500 µM H2O2 n’ont pas démontré un effet similaire, indiquant que les doses plus élevées deh2o2 fixent ces cellules cancéreuses pulmonaires de manière similaire à l’éthanol ou au méthanol., Ainsi, H2O2 semble induire simultanément la mort des cellules cancéreuses du poumon par nécrose et apoptose, en fonction de sa concentration. En particulier, 75 et 100 µMH2O2 semblaient déclencher simultanément l’apoptose et la nécrose dans les cellules Calu-6, car ces doses d’H2O2 n’augmentaient pas les pourcentages de cellules sub-G1 par rapport aux cellules traitées par 50 µM H2O2, ainsi qu’il n’y avait aucun changement dans les niveaux de l’intactforme de la protéine PARP. Il est nécessaire d’évaluer l’activité de la lactate déshydrogénase extracellulaire dans les cellules cancéreuses du poumon traitées avec 50-500 µM H2O2 pour la détection de la mort cellulaire nécrotique., Des études antérieures ont mis en évidence un rôle de H2O2 dans l’arrêt et la progression de la phase du cycle cellulaire en ajustant les protéines liées au cycle cellulaire (23,24).dans ce cadre, le traitement par 75 ou 100 µMH2O2 parmi les doses testées a significativement montré un arrêt de la phase G1 dans les cellules Calu-6 et A549. Ainsi, l’arrêt G1phase ainsi que l’induction de la mort cellulaire est le potentialmécanisme derrière l’atténuation de la croissance cellulaire uponh2o2 traitement. Cependant, H2O2 n’a pas fait d’arrêt de phase spécifique du cycle cellulaire dans les cellules HeLa (20)., Ces résultats ont indiqué que le stress oxydatif induit par 2O2 manifestait ses effets sur la progression du cycle cellulaire en fonction du type de cellule et de la dose de 2O2.

Les inhibiteurs de la Caspase utilisés dans cette expérience ont échoué à atténuer l’inhibition de la croissance dans les cellules cancéreuses Calu-6 et A549 traitées par 2O2,alors que ces inhibiteurs ont considérablement empêché la mort cellulaire induite par H2O2 dans ces cellules.Bien que L’H2O2 ait augmenté dans une certaine mesure l’activité de la caspase-8 dans les deux cellules cancéreuses du poumon, l’inhibiteur de la caspase-8 a considérablement atténué la mort cellulaire déclenchée parh2o2., Ainsi, une légère altération de l’activité de la caspase-8 semble avoir un fort impact sur la voie pro-apoptotique dans les cellules du cancer du poumon traitées par H2O2. Ces résultats ont également indiqué que les voies des récepteurs de la mort cellulaire et mitochondriale étaient mutuellement nécessaires pour l’induction de l’apoptose dans les cellules cancéreuses lunaires traitées par H2O2. Il serait important de déterminer commenth2o2 affecte la voie du récepteur de mort cellulaire pour induire l’apoptose dans les cellules cancéreuses du poumon. En ce qui concerne la MMP(δʿm), les inhibiteurs de la caspase n’ont pas eu d’effet significatif sur la perte des cellules Calu-6 et A549 traitées par MMP (δʿm) inH2O2., En outre, ces inhibiteurs n’ont pas rétabli la diminution des niveaux de MMP(ΔΨm) dans les cellules du cancer du poumon traitées par H2O2. Au lieu de cela, l’inhibiteur de la caspase-9 a amélioré les niveaux de thedecreased dans ces cellules. Il est plausible que la perte de MMP (ΔΨm) après le traitement avech2o2 a activé diverses voies de récepteur tomitochondrial et de mort cellulaire liées aux caspases, induisant par conséquent l’apoptose et l’activation des caspases parh2o2 ne pourrait pas améliorer positivement la perte de MMP(ΔΨm)., En outre, la perte de MMP (ΔΨm) induite par H2O2 peut ne pas être suffisante pour provoquer complètement l’apoptose dans les cellules Calu-6 et A549 sous la régulation à la baisse de l’activité de la caspase.

En conclusion, H2O2 a inhibé la croissance des cellules cancéreuses du poumon par la mort cellulaire et la phase G1 du cycle cellulaire. La mort cellulaire Calu-6 et A549 causée parh2o2 résulte d’une nécrose, ainsi que d’une apoptose dépendante de l’ascaspase (Fig.7). Les présents résultats fournissent des informations utiles pour comprendre l’effet cytotoxicologique d’exogenousH2O2 sur les cellules cancéreuses du poumon en ce qui concerne la croissance et la mort des cellules., En outre, de nouvelles stratégies pour le traitement du cancer du poumon basées sur L’utilisation de H2O2 peuvent être utiles pour réduire la mortalité liée à cette bénignité.

Remerciements

ce n’est Pas le cas.

Financement

La présente étude a été soutenue par une subvention de la Fondation nationale de la recherche de Corée (NRF) financée par le gouvernement coréen (MSIP; 2016R1A2B4007773) et soutenue par le « programme de soutien du Fonds de Construction ResearchBase » financé par L’Université Nationale de Chonbuk en 2018.,

disponibilité des données et du matériel

toutes les données générées ou analysées au cours de cette étude sont incluses dans cet article publié.

contributions des auteurs

WHP a été le seul contributeur à la conception et à la conception, à l’acquisition des données, à l’analyse et à l’interprétation des données et à la rédaction du manuscrit. WHP est responsable de tous les aspects du travail en veillant à ce que les questions liées à l’exactitude ou à l’intégrité de toute partie du travail fassent l’objet d’une enquête et d’une résolution appropriées.

approbation et consentement déontologiques pour participer

Sans objet.,

consentement du Patient à la publication

Sans objet.

intérêts divergents

L’auteur déclare qu’il n’a pas competinginterests.,-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium

FITC

de l’isothiocyanate de fluorescéine

PI

l’iodure de propidium

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