qu’est-ce que RNA-seq?
L’ARN-seq (RNA-sequencing) est une technique qui permet d’examiner la quantité et les séquences d’ARN dans un échantillon en utilisant le séquençage de nouvelle génération (NGS). Il analyse le transcriptome des modèles d’expression génique codés dans notre ARN. Ici, nous examinons pourquoi L’ARN-seq est utile, Comment fonctionne la technique et le protocole de base couramment utilisé aujourd’hui1.
quelles sont les applications de L’ARN-seq?,
RNA-seq nous permet d’étudier et de découvrir le transcriptome, le contenu cellulaire total des ARN, y compris l’ARNm, l’ARNr et l’ARNt. Comprendre le transcriptome est essentiel si nous voulons relier l’information sur notre génome à son expression protéique fonctionnelle. L’ARN-seq peut nous dire quels gènes sont activés dans une cellule, Quel est leur niveau d’expression et à quel moment ils sont activés ou désactivés2. Cela permet aux scientifiques de mieux comprendre la biologie d’une cellule et d’évaluer les changements pouvant indiquer une maladie., Certaines des techniques les plus populaires qui utilisent L’ARN-seq sont le profilage transcriptionnel, l’identification SNP, l’édition de L’ARN et l’analyse différentielle de l’expression génique3.
Cela peut donner aux chercheurs des informations vitales sur la fonction des gènes. Par exemple, le transcriptome peut mettre en évidence tous les tissus dans lesquels un gène de fonction inconnue est exprimé, ce qui pourrait indiquer quel est son rôle. Il capture également des informations sur les événements d’épissage alternatifs (Figure 1), qui produisent des transcriptions différentes à partir d’une seule séquence génique. Ces événements ne seraient pas captés par le séquençage de l’ADN., Il peut également identifier les modifications post-transcriptionnelles qui se produisent pendant le traitement de l’ARNm, telles que la polyadénylation et le plafonnement 5’2.
Figure 1: ARN-SEQ data uses utilise des lectures courtes de l’ARNm qui est exempt d’ADN non codant intronique. Ces lectures doivent ensuite être alignées sur le génome de référence.
comment fonctionne L’ARN-seq?
Les premières techniques ARN-seq utilisaient la technologie de séquençage Sanger, une technique qui, bien qu’innovante à l’époque, était également à faible débit, coûteuse et inexacte., Ce n’est que récemment, avec l’avènement et la prolifération de la technologie NGS, que nous avons pu tirer pleinement parti du potentiel D’ARN-seq4.
la première étape de la technique consiste à convertir la population d’ARN à séquencer en fragments d’ADNc (une bibliothèque d’ADNc). Cela permet à L’ARN d’être mis dans un flux de travail NGS. Des adaptateurs sont ensuite ajoutés à chaque extrémité des fragments. Ces adaptateurs contiennent des éléments fonctionnels qui permettent le séquençage; par exemple, l’élément d’amplification et le site de séquençage primaire., La bibliothèque d’ADNc est ensuite analysée par NGS, produisant de courtes séquences qui correspondent à l’une ou l’autre des extrémités du fragment. La profondeur à laquelle la Bibliothèque est séquencée varie en fonction des techniques pour lesquelles les données de sortie seront utilisées. Le séquençage suit souvent des méthodes de séquençage à lecture unique ou à extrémité appariée. Le séquençage à lecture unique est une technique moins coûteuse et plus rapide (pour référence, environ 1% du coût du séquençage Sanger) qui séquestre l’ADNc à partir d’une seule extrémité, tandis que les méthodes à extrémité appariée se séquencent à partir des deux extrémités, et sont donc plus coûteuses et consommant du temps5,6.,
Un autre choix doit être fait entre les protocoles spécifiques aux volets et les protocoles non spécifiques aux volets. La première méthode signifie que l’information sur le brin D’ADN qui a été transcrit est conservée. La valeur des informations supplémentaires obtenues à partir de protocoles spécifiques aux brins en font l’option favorable.
ces lectures, dont il y aura plusieurs millions à la fin du flux de travail, peuvent ensuite être alignées sur un génome de référence et assemblées pour produire une carte de séquence D’ARN qui couvre le transcriptome7.,
ARN-seq vs microréseaux: pourquoi L’ARN-seq est considéré comme supérieur
L’ARN-seq est largement considéré comme supérieur à d’autres technologies, telles que l’hybridation de microréseaux. Il y a plusieurs raisons pour le statut bien considéré de RNA-seq
un protocole RNA-seqexpériment Planning
la préparation avant de commencer votre expérience RNA-seq est essentielle. Questions à répondre avant de commencer include10:
•Quelle méthode de purification de L’ARN utilisez-vous?
•de combien de lectures aurez-vous besoin?
•quelle plateforme utiliserez-vous?,
•quel génome de référence utiliserez-vous?
•Comment évaluez-vous la qualité de votre ARN?
•avez-vous besoin d’enrichir votre ARN cible?
•voulez-vous barcode votre ARN?
•ai-je assez de répliques biologiques et techniques?
•séquençage à lecture unique ou à extrémité appariée?
préparation de la bibliothèque d’ADNc
Après avoir pris en compte ces points, vous pouvez commencer à préparer votre bibliothèque d’ADNc. Cela nécessitera l’ajout des « séquences d’adaptation » spécifiques à la plate-forme et l’amplification de l’ADN, mais la procédure exacte sera très spécifique à la plate-forme utilisée à ce stade., L’amplification de l’ADN implique une synthèse de premier brin médiée par la transcriptase inverse suivie d’une synthèse de deuxième brin médiée par L’ADN polymérase 10,11.
séquençage de l’ADNc
Une fois la bibliothèque préparée et les adaptateurs ajoutés, vous pouvez utiliser votre plate-forme de séquençage choisie pour séquencer votre bibliothèque d’ADNc à la profondeur souhaitée. Une fois que vos données de transcription ont été produites, vous pouvez mapper les données à votre génome de référence., Le processus d’alignement peut être compliqué par la présence de variantes et de modifications d’épissure, et le choix du génome de référence utilisé variera également la difficulté de cette étape. Les logiciels tels que STAR sont utiles à ce stade, tout comme les outils de contrôle qualité comme Picard ou Qualimap12.
analyse des données ARN-Seq
Après l’étape d’alignement, vous pouvez vous concentrer sur l’analyse de vos données. Des outils comme Sailfish, RSEM et BitSeq12 vous aideront à quantifier vos niveaux d’expression, tandis que des outils comme MISO, qui quantifie alternativement les gènes épissés, sont disponibles pour une analyse plus spécialisée13., Il existe une bibliothèque de ces outils, et la lecture des critiques et des rafles est votre meilleur moyen de trouver le bon outil pour votre recherche.
pour résumer, L’ARN-seq moderne est bien établi comme l’option supérieure aux puces à puces et restera probablement l’option préférée pour le moment.
5.https://systemsbiology.columbia.edu/genome-sequencing-defining-your-experiment
6.https://emea.illumina.com/science/technology/next-generation-sequencing/paired-end-vs-single-read-sequencing.html
9.https://cofactorgenomics.com/advantages-rna-seq-over-microarray-technology/
10.http://bioinformatics.ucdavis.edu/docs/2015-june-workshop/_downloads/Th_MB_RNASeq_Intro.pdf
11.https://rnaseq.uoregon.edu/#library-prep-stranded-libraries