Animaux
toutes les expériences ont été menées sur des souris C57/B6 mâles et femelles non reproductrices (âgées de 2 à 3 mois). Chaque sexe a contribué à environ la moitié du nombre total d’animaux dans chaque expérience. Les animaux étaient logés dans un cycle sombre/clair de 12/12 h et avaient un accès illimité à la nourriture et à l’eau., L’utilisation de souris dans ces expériences était conforme au Guide pour les soins et L’utilisation des animaux de laboratoire et les protocoles expérimentaux ont été approuvés par le Comité institutionnel de soins et D’utilisation des animaux de L’Université de Californie du Sud (IACUC).
exposition à la lumière
Les yeux ont été dilatés avec une Solution ophtalmique de Tropicamide à 0,5%, USP (AKORN) et une Solution ophtalmique de chlorhydrate de phényléphrine à 2,5%, USP (AKORN). Les souris ont été adaptées à l’obscurité pendant la nuit., Ils ont été maintenus dans l’obscurité ou exposés à une lumière fluorescente blanche froide diffuse à un niveau de luminescence de 5000 lux pendant 30 min à 1 h avant d’être euthanasiés. Les échantillons adaptés à l’obscurité pour les deux méthodes ont été préparés dans une chambre noire sous lumière infrarouge et toutes les procédures impliquant des tissus adaptés à l’obscurité ont été effectuées à l’aide d’un microscope à dissection équipé de convertisseurs infrarouges (B. E. Meyers & Co, Inc.). Les échantillons exposés à la lumière ont été traités sous une portée de dissection à la lumière de la pièce.,
dissection de la rétine
des souris ont été euthanasiées par inhalation d’isoflurane suivie d’une luxation cervicale. Les yeux ont été énucléés et les rétines ont été isolées dans une boîte de Pétri de 35 × 10 mm remplie du tampon/solution approprié décrit ci-dessous. La cornée, le cristallin et l’humeur vitrée ont été retirés de chaque œil et l’épithélium pigmenté rétinien (EPR) et la sclérotique ont été soigneusement décollés de chaque rétine. Les rétines isolées ont été hémisectées avec un scalpel de plumes dans un plat de 60 × 15 mm et les bords ont été coupés pour engendrer deux rectangles., La réduction au minimum de la courbure de chaque rétine réduite de moitié a aidé à aplatir la rétine et a assuré un pelage précis des couches rétiniennes. Une coupe appropriée des bords repliables de la rétine est essentielle: si la rétine a des bords repliables lorsqu’elle est placée sur le papier filtre, cela entraînera une diminution du rendement en ROS isolés et, plus important encore, sera contaminée par d’autres couches rétiniennes.
immunocytochimie
avant l’énucléation, le pôle supérieur de la cornée a été marqué par cautérisation et la cornée, le cristallin et le vitré ont ensuite été enlevés., Les ocelles restants ont été placés dans 4% de paraformaldéhyde dans du PBS pendant 15 min et rincés 3 fois pendant 10 min dans du PBS. Les gobelets oculaires ont été cryoprotégés dans 30% de saccharose dans du PBS pendant 2 h, placés dans le composé Tissue-teck® O. C. T. (Sakura Finetek, USA) et rapidement congelés dans du N2 liquide. Les blocs congelés ont été sectionnés à 10 µm dans un cryostat (CM 3050 S, Leica Microsystems) et stockés à -80 °C. Avant l’incubation des anticorps, les sections ont été équilibrées à température ambiante (RT) pendant 15 min., Pour la coloration GNAT1 à l’aide de L’anticorps monoclonal de souris TF-15, la récupération d’épitope a été réalisée: les sections ont été traitées pendant 2 min RT avec 0,02 mg/ml de protéinase K dans un tampon bloquant (2% d’albumine de sérum bovin, 2% de sérum de chèvre, 0,3% de Triton X-100 dans 1x PBS) et chauffées à 65 °C pendant 10 s, suivies de cinq rinçages avec PBS. Un tampon de blocage a ensuite été appliqué à toutes les sections pendant 1 h. Les Sections ont été incubées avec L’anticorps de lapin contre ARR1 (c10c10 dilué 1:100 dans un tampon de blocage) ou TF-15 (CytoSignal, dilué 1:200 dans un tampon de blocage)., Les sections ont été rincées et incubées avec un anticorps secondaire marqué à la fluorescéine (Vector Laboratories). Toutes les sections ont ensuite été doublement colorées avec l’anticorps bioinylé contre la rhodopsine (1D4 dilué 1:300 dans un tampon de blocage). Les sections ont été rincées et incubées avec de la rhodamine avidine D (1: 100, Vector Laboratories). Les Images ont été obtenues à l’aide d’un microscope Zeiss AxioPlan2. Les conditions de lumière et d’obscurité ont été imagées en utilisant des temps d’exposition identiques.,
collecte de ROS par pelage séquentiel avec du papier filtre
la méthode de pelage de papier filtre a été adaptée d’une technique permettant d’exposer des cellules bipolaires marquées par fluorescence dans un support plat rétinien pour des enregistrements de patch clamp . Éplucher les couches multiples de la cellule photoréceptrice avec du papier filtre expose progressivement les dendrites et les corps cellulaires bipolaires pour un accès plus facile aux lectures de stimulation électrique et de patch clamp. Nous avons constaté que les sous-produits pelés, les couches de photorécepteurs collées sur le papier filtre, se prêtaient à des analyses Western blot ultérieures.,
le milieu D’Ames a été utilisé pour la manipulation de tissus rétiniens vivants (Sigma-Aldrich A1420). Deux tampons différents ont été préparés: Ames ‘ – HEPES (à 1 L ajouter 2,38 G HEPES, 0,877 G NaCl, pH 7,4) et Ames’-bicarbonate (à 1 L ajouter 1,9 g NaHCO3, pH 7,4). Les deux ont été préparés à l’avance, filtrés stériles et stockés à 4 °C. Toutes les procédures ont été effectuées à RT., Avant la dissection rétinienne, 50 à 100 mL D’Ames’-HEPES ont été barbotés avec 100% D’O2 dans un flacon de 100 mL GibcoTM (Thermo Fisher, États-Unis) et 50 à 100 mL D’Ames’-bicarbonate ont été barbotés avec 95% D’O2 et 5% de CO2 dans un récipient étanche à la lumière pendant 15 à 20 min avant utilisation.
les rétines ont été préparées comme décrit dans la section « dissection de la rétine » et stockées dans un récipient étanche à la lumière avec du bicarbonate Ames barboté avec 95% D’O2 et 5% de CO2 pour maintenir le pH physiologique., Cette condition d’incubation est identique à celle utilisée par les physiologistes de la rétine pour les enregistrements d’électrorétinogrammes ex vivo ou d’électrodes d’aspiration , et peut maintenir la viabilité et la fonctionnalité des tissus pendant plusieurs heures. Un morceau de rétine rectangulaire coupé en deux a été utilisé pour chaque procédure de peeling. Le tissu a été transféré via une pipette de transfert en plastique de 1,7 mL (Coupe de la pointe) dans une boîte de Pétri de 35 × 10 mm contenant des ames-HEPES oxygénés. Le milieu a été rafraîchi toutes les 10 minutes pendant le processus d’épluchage pour maintenir l’état oxygéné., La rétine en solution a été orientée avec le côté photorécepteur vers le bas à l’aide d’une pince à épiler et de la pipette de transfert. Un morceau de papier filtre rectangulaire de 5 mm × 2,5 mm découpé dans du papier filtre de qualité 413 VWR (diamètre 5,5 cm, taille des pores 5 µm, VWR, États-Unis) a été placé dans la boîte de pétri à côté de la rétine. La rétine a été soigneusement déplacée avec une pince à épiler (en maintenant légèrement les bords) sur le papier filtre avec le côté photorécepteur vers le bas. Une fois que la rétine a été centrée sur le papier filtre, les deux ont été soigneusement soulevés hors des ames-HEPES., Le côté inférieur du papier filtre (le côté sans la rétine) a été épongé sur une serviette en papier pour absorber le liquide sur le papier filtre (2-3 touches). Cela a créé une adhérence sûre entre les cellules photoréceptrices et les fibres du papier filtre, et cet attachement était important pour enlever la couche ROS. Une goutte D’Ames ‘ – HEPES de la boîte de Pétri a été placée sur la rétine, et le papier filtre a été à nouveau épongé sur la serviette en papier. Cela a été répété au total trois fois., Le papier filtre avec la rétine a ensuite été replacé dans la boîte de Pétri et immergé, et le tissu retiré du papier filtre avec une pince à épiler. On a pris soin de ne toucher que le périmètre extrême de la rétine pour préserver l’intégrité structurelle de la rétine. Pour faciliter le processus de pelage, les bords de la rétine ont été délicatement décollés du papier filtre de chaque côté, desserrant l’adhérence de la rétine au papier filtre., Une fois que la rétine a été retirée du papier filtre, la surface inférieure du papier filtre a été épongée sur une serviette en papier et placée dans un tube étiqueté +ROS et a été maintenue sur de la glace. Le processus de pelage décrit ci-dessus a été répété environ 7-8 fois. Après 5 Peelings, la rétine est devenue plus mince, plus transparente et a tendance à se déchirer. Après épluchage, le tube + ROS contenant les papiers filtres collectés et le reste de la rétine pelée coupée en deux a été placé dans le tube-ROS, congelé sur de la glace carbonique et stocké à -80 °C.,
séparation des compartiments photorécepteurs par pelage de la rétine lyophilisée
Cette méthode a été adaptée de celle décrite par M. E. Guido, et al. , qui a conçu une méthode de pelage de ruban ScotchTM qui utilisait des rétines de poussin lyophilisées pour séparer sélectivement la rétine en différentes couches (cellules photoréceptrices, couche nucléaire interne et cellules ganglionnaires)., Étant donné que les rétines de différents modèles animaux ont des distributions de bâtonnets et de cônes différentes et peuvent se séparer de manière asymétrique avec du ruban adhésif après lyophilisation, nous avons adapté cette méthode et exploré son utilité pour la séparation des compartiments de bâtonnets des rétines de souris.
lyophilisation de rétines isolées
les rétines ont été préparées comme décrit dans la section « dissection rétinienne ». Des Sonneurs froids (NaCl de 130 mM, KCl de 3,6 mM, MgCl2 de 2,4 mM, CaCl2 de 1,2 mM, HEPES de 10 mM, EDTA de 0,02 mM, pH 7,4) ont été utilisés pendant la dissection. D’autres tampons physiologiques, tels que les ames’-HEPES, pourraient également être utilisés., Parce que plusieurs échantillons étaient souvent manipulés en même temps, les morceaux de papier filtre de 5 × 2,5 mm (Papier filtre qualitatif de grade 1 Whatman® (diamètre 9 cm, taille des pores 11 µm, GE Healthcare, États-Unis)) ont été étiquetés à l’avance avant d’être placés dans une boîte de Pétri remplie de tampon cold Ringer. Pour chaque échantillon, un morceau de rétine rectangulaire coupé en deux a été placé sur le papier filtre à l’aide d’une pipette de transfert de 1,7 mL (pointe coupée) avec le côté de la cellule ganglionnaire vers le bas et le côté du segment externe du photorécepteur vers le haut., Une fois le tissu centré sur le papier filtre, les deux ont été soulevés hors du tampon de la sonnerie et le fond du papier filtre (le côté sans la rétine dessus) a été épongé sur une serviette en papier (2-3 touches) pour faciliter la fixation de la couche de cellules ganglionnaires sur le papier filtre. Une goutte de Cold Ringer a été placée sur la rétine, et le fond du papier filtre a de nouveau été épongé sur la serviette en papier. Cela a été répété au total trois fois. Le tampon de la sonnerie a été remplacé par un nouveau tampon de la sonnerie froide après chaque préparation d’échantillon., Le papier filtre avec rétine attachée a été placé dans une boîte de Pétri remplie de sonneries froides jusqu’à ce que tous les échantillons soient traités de la même manière. Enfin, chacun a été à nouveau soulevé hors de la solution, le fond du papier filtre épongé sec, et une goutte de PBS froid placé sur le papier filtre à côté de la rétine, le fond du filtre à nouveau épongé, et placé dans une boîte de Pétri propre et sec 35 × 10 mm. Le but de cette étape était de rincer la sonnerie plus complexe avec du PBS pour réduire la quantité de sel séché sur le tissu lyophilisé., Après que tous les échantillons de tissus aient été traités avec cette dernière étape de rinçage et collectés dans la boîte de Pétri propre, la boîte a été enveloppée de deux couches de 2,5 × 2,5 pouces carrés de papier d’aluminium, avec de petits trous, de sorte que les échantillons de rétine adaptés à l’obscurité ne soient pas exposés Les petits trous permettaient au liquide N2 d’accéder à l’intérieur, remplissant la boîte de Pétri, et des précautions ont été prises pour s’assurer que les trous étaient décalés afin que la boîte de Pétri soit enveloppée étanche à la lumière., La boîte de Pétri a ensuite été placée dans un flacon Labconco de 600 mL à l’aide d’un lyophilisateur VirTis Benchtop 2 K (SP Scientific, USA) pendant 30 min pour lyophiliser le tissu.
pelage des couches rétiniennes par scotchtm
des tissus rétiniens lyophilisés ont été stockés à -80 °C dans un récipient rempli de Dreritetm (W. A. Hammond Dryerite Co, USA) ou ont été isolés sous forme de +ROS, +RIS et-ROS / ris-tissu appauvri (- OIS), congelés à nouveau comme ci-dessus ou traités pour Western blots le même jour. Toutes les procédures d’épluchage ont été effectuées sous la lumière de la pièce. Bandes plus petites que 2.,5 mm de largeur ont été coupés et placés sur le bord du distributeur de ruban jusqu’à ce qu’ils soient coupés en morceaux rectangulaires. Une rétine lyophilisée fixée au papier filtre Whatman® a été placée dans une boîte de Pétri propre de 10 cm. Un petit morceau rectangulaire de ScotchTM (légèrement plus grand que la surface du tissu) a été coupé et soigneusement posé sur le dessus de la rétine lyophilisée. Placer la bande sur le dessus de la rétine lyophilisée était presque suffisant pour attacher la couche de ROS teintée d’orange à la bande., Pour assurer un contact complet du ROS avec la bande, une légère pression a été appliquée avec une pince à épiler sur le dessus de la bande pour assurer le contact avec la surface supérieure. Après avoir soigneusement épluché la bande, la couche de ROS teintée d’orange a été collée à la bande et séparée du reste de la rétine. Cette fraction a été marquée + ROS et placée dans un tube microfuge propre. Souvent, un mince film blanc était visible à la surface fracturée de la couche orange sur la première pelure de ruban., Cette surface a été enlevée par Plus de pelures de ruban jusqu’à ce qu’elle soit complètement enlevée et que la couleur orange de la couche ROS soit ramenée à la surface. Cette couche blanche initialement fixée à ROS a été placée dans un tube séparé et étiquetée fraction +RIS. Du ruban adhésif a été utilisé pour enlever les restes de tissu rétinien du papier filtre et a été placé dans un tube étiqueté-OIS., La quantité de pression appliquée à la bande pour le pelage initial de la couche ROS teintée d’orange a affecté la façon dont l’échantillon lyophilisé fractionné; trop de pression a causé toute la rétine lyophilisée à décoller le papier filtre sur la bande et trop peu de pression n’a pas séparé la couche orange supérieure de la rétine. Quelques passes sur la bande en utilisant une pression minimale avec une pince à épiler ont été utiles pour ressentir la quantité minimale et maximale de pression à ajouter au haut de la bande.,
préparation de L’échantillon pour Western blot: pelage avec du papier filtre
Les tubes +ROS contenant les papiers filtres ont été soumis à un essorage rapide dans un microcentrifuge pendant 2 s et l’excès de liquide éliminé. Chaque tube a été traité séparément (une rétine coupée en deux) ou deux tubes (deux rétines coupées en deux) ont été combinés pour obtenir un matériau plus concentré. L’isolat + ROS dans un seul tube a été homogénéisé dans 45-60 µL de tampon RIPA froid (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1% désoxycholate de sodium, 0,1% SDS, 1 mM EDTA, 0.,1 M PMSF, inhibiteur complet de la mini protéase (Roche Applied Sciences)), et l’isolat-ROS dans un seul tube a été homogénéisé dans un tampon RIPA de 80-100 µL. Lorsque deux tubes ont été combinés, 80-110 µL de tampon RIPA froid ont été utilisés pour homogénéiser +ROS et 100-150 µL de tampon froid ont été utilisés pour-ROS. Tous les tubes ont été homogénéisés pendant 1 min avec un pilon autoclavé. Un grand soin a été pris pour s’assurer que les morceaux de papier filtre dans les tubes +ROS étaient maintenus sur le côté des tubes et restaient en contact avec le pilon au lieu d’être coincés au fond., Après homogénéisation, des pincettes stériles ont été utilisées pour déplacer les morceaux de papier filtre sur le côté du tube +ROS, suivi d’un essorage de 2 à 4 s dans le microcentrifuge. Cette rotation a extrait le liquide du papier, et le liquide a été transféré dans un tube propre et traité pour Western blot comme décrit ci-dessous. Ce fut la plus longue étape, et si pas effectué correctement, une grande partie de l’échantillon peut être absorbé par les morceaux de papier filtre. Pour maximiser la récupération de l’échantillon, la taille des morceaux de papier filtre utilisés pour les pelures doit être coupée pour correspondre à la zone du tissu rétinien.,
préparation de L’échantillon: pelage avec du ruban ScotchTM
semblable à la méthode de pelage par filtre, deux tubes, contenant chacun une couche pelée d’une demi-rétine, ont été combinés pour augmenter la concentration en protéines. Les échantillons +ROS et + RIS ont été homogénéisés dans 100-115 µL, et les échantillons-OIS dans 125 µL de tampon RIPA froid. Tous les tubes ont été homogénéisés pendant 1 min. Un grand soin a été pris pour s’assurer que la bande dans les tubes +ROS, +RIS et-OIS restait en contact avec le pilon et que la bande était maintenue sur le côté des tubes au lieu d’être collée au fond., Après homogénéisation, des pinces stériles ont été utilisées pour déplacer des morceaux de ruban sur le côté des tubes. Les tubes ont été filés dans la mini centrifugeuse pendant 2-4 s, après quoi les morceaux de ruban séchés ont été soigneusement enlevés.
quantification des protéines, électrophorèse sur gel et immunoblots protéiques
Un kit D’analyse des protéines BCA (Thermo Scientific, États-Unis) a été utilisé pour déterminer la quantité totale de protéines dans chaque échantillon. Deux microlitre de DNaseI (10 unités/µL, Roche, Suisse) ont été ajoutés aux échantillons et ont été laissés à température ambiante pendant 30 min., Un volume approprié de tampon d’échantillon 4X SDS (40% glycérol, 240 mM Tris Base pH 6,8, 8% SDS, 5% ßME, 0,04% bromophénol bleu) a été ajouté à l’homogénat.,tr>
Approximately 10 μg of protein lysate was loaded per lane and separated on a pre-cast polyacrylamide Bis-Tris gel with a 4–12% gradient (Life Technologies, USA) and transferred onto nitrocellulose membrane., Les membranes ont été bloquées dans un tampon à 10% de lait/TBS-T pendant 1 h à RT, et incubées pendant une nuit avec les anticorps suivants: anticorps anti-ARR1 de lapin (1: 1000, ref), anticorps monoclonal anti-GNAT1 de souris (TF-15, 1:1000, CytoSignal), anticorps anti-β actine de lapin (1:5000, GeneTex Inc.), anticorps anti-RGS9 de lapin (1:1000), anticorps anti-gß5l/S de lapin (CT215) (1:2000) et anticorps polyclonal anti-cytochrome C de lapin (1:500, Santa Cruz, sc-7159). Les Membranes ont été incubées avec des anticorps secondaires marqués par fluorescence (1:10 000, LI-COR Biosciences) à RT pendant 1 h., Les bandes protéiques ont été détectées par Odyssey® infrared imaging system (LI-COR Biosciences, USA) et L’intensité de fluorescence des bandes individuelles a été quantifiée à L’aide D’ImageJ. Les signaux GNAT1, ARR1 et RGS9 ont été normalisés contre Gß5L pour les échantillons +ROS, +RIS et contre l’actine pour les échantillons-ROS et-OIS. Pour chaque expérience indépendante, les signaux fluorescents de chaque protéine dans chaque compartiment ont également été normalisés par rapport aux signaux combinés de tous les compartiments rétiniens. Des tests T à 2 queues non appariés ont été utilisés pour déterminer les différences entre deux groupes.