Auswirkungen von Mutagenen auf die DNA-Sequenz in Pflanzen
Hintergrund:
Moderne Pflanzenzüchter und Landwirte können eine Fülle natürlicher Biodiversität ausnutzen, die durch die Anwendung von Mutationsinduktionstechniken weit verbreitet sein kann., Die Auswirkungen der induzierten Mutation auf die Verbesserung der Ernte spiegeln sich in den 2316 offiziell registrierten Sorten wider (IAEA-Datenbank zu amtlich registrierten Mutantensorten, MVD), die eine neuartige induzierte Variation aufweisen. Darüber hinaus sind etwa drei Viertel davon direkte Mutantensorten, die aus der Behandlung mit Gammastrahlen gewonnen werden, was die Bedeutung physikalischer Mutagene unterstreicht. All dies führt zu enormen wirtschaftlichen Auswirkungen auf die Landwirtschaft und die Nahrungsmittelproduktion, die derzeit in Milliarden von Dollarenund Millionen kultivierter Hektar geschätzt werden (Ahloowalia et al. in prep.)., Obwohl das agronomische Potenzial der induzierten Mutation gut verstanden ist, wurden die genauen Auswirkungen verschiedener mutagener Agenzien auf die DNA-Sequenz in Pflanzen nie beschrieben. Darüber hinaus haben in den letzten Jahren neuartige Reverse Genetics-und Gene Discovery-Technologien ein erneuertes Interesse an induzierter Mutation geweckt. Für diese neuen Anwendungen ist es notwendig, die Arten von Mutationen, die von den verschiedenen Mutagenklassen erzeugt werden, klarer zu verstehen und ihre Häufigkeit und Verteilung entlang des Genoms zu messen., Heute und zum ersten Mal sind die Technologien vorhanden, um die Experimente durchzuführen, die notwendig sind, um dieses Verständnis zu erlangen.
Mutagene Mittel können in drei Kategorien eingeteilt werden: physikalische (z. B. Gammastrahlen), chemische (z. B. Ethylmethansulfonat) und transponierbare Elemente (wie Transposons, Retrotransposons, T-DNA,Retroviren). Gegenwärtig liegen nur begrenzte Daten über den Umfang der genetischen Wirkungen vor, die auf molekularer Ebene in Pflanzen induziert werden, und über die Spezifität undlative Effizienz dieser verschiedenen Wirkstoffkategorien., Diese Effekte beinhalten DNA-Schäden, die zu Basenpaarveränderungen (Single/simple Nucleotide Polymorphismen,SNPs), kleinen Einfügungen und Deletionen (Indels) und chromosomalen Umlagerungen führen. Noch weniger ist bekannt, wie induzierte Mutationen mit epigenetischen Prozessen wie Methylierung, Aktivierung von Retroelementen und Störung der DNA-Struktur höherer Ordnung interagieren.,
Während die Züchter die Mutationsinduktion zur Erweiterung der genetischen Basis des Keimplasmas verwendeten und die Mutantenlinien direkt als neue Sorten oder als Quellen neuer Variationenin Zuchtprogrammen verwendeten, war die Kenntnis der genauen Art der induzierten Mutationen nicht erforderlich. Intuitiv eine konservative Ebene der kleinen Basispaarumlagerung und Löschung wurde als ideal angesehen. Heutzutage hat sich der Einsatz von Mutationstechniken über Anwendungen in der Zucht hinaus auf die Genfindung und die umgekehrte Genetik ausgeweitet., Thesenew hohe-Durchsatz Anwendungen erfordern, dass bestimmte Klassen von Mutationen induziert werden mit hoher Effizienz über den gesamten Ernte-plant Genome, und folglich knowledgeof die genaue Art der induzierten mutation ist immer ein Problem.
Hochdurchsatz-Gen-Discovery-Methoden hängen stark von einfügbaren „Knockout“ – Linien, den jetzt klassischen „Gene Machines“ und Deletionsbibliotheken ab. Insertionale Mutagenesisinvolves Induzieren einer erhöhten Aktivität der Transposition bekannter transposierbarer Elemente (z., retrotransposons, die dazu neigen, sich in aktive Gene zu transponieren), um eine Reihe von Linien zu produzierenin der Theorie wurde jedes Gen im Genom durch die Transposoneinfügung inaktiviert. Diese Linien können verwendet werden,um Gene zu identifizieren, die bestimmte Phänotypen verursachen, oder umgekehrt, kann verwendet werden, um die Genfunktion zu identifizieren, indem nach einem Phänotyp gesucht wird, der mit der Inaktivierung eines bestimmten bekannten Gens assoziiert ist. Die Insertionsmutanten haben jedoch eine Atendenz, die instabil ist (z. B. Exzision des Transposon-Tags, z., Ac / Ds-Binärsystem, in der nächsten Generation könnte dazu führen, dass der Phänotyp auf den ursprünglichen übergeordneten Typ zurückkehrt, oder Aktivierung von Retrotransposon-Tags durch verschiedene Spannungen könnte Insertionsereignisse multiplizieren, z. B. während der Mikropropagation). Im Vergleich zur insertionalen Mutagenese bietet Konventionellmutationsinduktion (dh Verwendung physikalischer oder chemischer Mittel) den Vorteil stabiler Mutationen.
Theoretisch werden bei der Herstellung von Löschbibliotheken in jeder Reihe von Zeilen mäßig große Löschungen von idealerweise 1 kb bis 100 kb Größe induziert.,Diese Deletionen sollten Segmente jedes Gens im genetischen Repertoire umfassen und mindestens durch eine Zeile in der Deletionsbibliothek dargestellt werden. Diese Deletionslinien können, wenn sie zusammen mit ganzen Genomgenarrays verwendet werden, verwendet werden, um Gene zu identifizieren, die für bestimmte Phänotypen verantwortlich sind, oder um die Assoziation bekannter Gene mit bestimmten Phänotypen zu bestätigen.
Eine neue und wichtige reverse genetics Ansatz ist „targeting induzierte lokale Läsionen in genomen‘ (BODENBEARBEITUNG)., Hier werden eine große Anzahl kleiner Veränderungen, entweder DNA-Basenpaar-Substitutionen oder kleine Löschungen, die sich über nicht mehr als einige Basenpaare erstrecken, in einer Reihe von Linien induziert. In diesen Linien kann die Genfunktion ermittelt werden, indem ein Phänotyp mit Veränderungen in einem bestimmten Gen assoziiert wird und neue Allele bekannter Gene erzeugt werden können.
In den kommenden Jahren werden sich neue Technologien wie diese verstärkt auf die praktische Pflanzenzüchtung auswirken. Sie erfordern jedoch unterschiedliche Arten von Mutationen, die bei bestimmten Frequenzen induziert werden., Um den Mutationsprozess anzupassen, muss verstanden werden, wie bestimmte Mutationsklassen erzeugt und über Genome verteilt werden. In der Vergangenheit war diesnicht möglich, weil es an Analysewerkzeugen und unzureichenden Kenntnissen sowohl über den Prozess der DNA-Schädigung als auch über die Architektur von Pflanzengenomen mangelte. Zudem wurden nur wenige Pflanzengene sequenziert. Heute bieten Hochdurchsatz-DNA-Sequenzierungsmethoden in Verbindung mit Bioinformatik und funktionellen genomischen Ansätzen umfangreiche Kenntnisse über die Genomarchitektur., Die vollständige genomische DNA-Sequenz einer Modell dicotyledonen Pflanze, Arabidopsis, und ein Modell monocotyledon, Reis ist vor kurzem verfügbar geworden. Auchwissenschaftler finden sich jetzt mit einer Reihe von Methoden, meist als molekulare Markertechnologien entwickelt, die angepasst werden können, um Veränderungen in der DNA-Sequenz zu quantifizieren. Alles in allem wird thestage die Wissenschaft von DNA-Schäden, die durch physikalische und chemische Mutagene hervorgerufen werden, von der Humangenetik auf Pflanzensysteme übertragen., Eine Reihe von Technologien kann nun verwendet werden, um die zugrunde liegende Basisrate spontaner Mutationen und die momentanen Auswirkungen von Mutationsmitteln über Generationen hinweg zu quantifizieren. So befinden sich Wissenschaftler nun endlich in der Lage, Experimente durchzuführen, die die Arten von Mutationen, die durch verschiedene Mutagene induziert werden, entwirren können, so dass zukünftige Benutzer der induzierten Mutation die Technologie in einem vollständig informierten nutzen könnenmanner.,
Ziele:
Ziel ist es, den Mechanismus der Mutationsinduktion in Pflanzen zu verstehen und die Arten (Basenpaarungen oder Deletionen), Frequenzen (Änderungsraten relativ zur Mutagendosis) und Muster (Induktion von Veränderungen in verschiedenen Teilen des Genoms) von Veränderungen in dnainduzierten durch eine Reihe von physikalischen und chemischen Mutagenen in einer Reihe von Schlüsselpflanzen zu quantifizieren Pflanzenarten. Molekulare Marker, DNA-Arrays und neuartige reverse genetische Methoden werden in einem einzigartigen Ansatz verwendet, um die Induktion von Mutationen zu analysieren und zu untersuchen, die in einer Reihe von Pflanzen von agronomischer Bedeutung hervorgerufen werden., Diese Ergebnisse werden verwendet, um Protokolle und Richtlinien zu liefern, die für die zukünftige Verwendung induzierter Mutationen in der Pflanzenbiologie und Pflanzenverbesserung wichtig sind. Die gewonnenen Erkenntnisse werden die Mitgliedstaaten bei der Verbesserung der Zuchtprogramme durch die Anwendung gezielter induzierter Mutationen und komplementärer genomischer Ansätze unterstützen, um die Nachhaltigkeit der Landwirtschaft, die Ernährungssicherheit und die wirtschaftliche Stabilität zu erhöhen. Dieses CRP wird neue Entwicklungen in der DNA-Analyse und Genomik nutzen, um Arten, Frequenzen, Raten und Mutationsmuster zu definieren, die durch die verschiedenen Mutagene induziert werden., Dies wird eine Wissensbasis schaffen, die zukünftige Benutzer induzierter Mutationstechnologien zur Verbesserung der Kulturpflanzen und zur Genomik leiten und unterstützen wird.Darüber hinaus wird es sich auf physikalische Mutagene wie Gamma-und schnelle Neutronen-oder Röntgenstrahlung konzentrieren. Ausgewählte chemische Mutagene werden auch verwendet, um die Relativeeffizienz beider Arten von mutagenen Mitteln zu vergleichen. Die Auswirkungen dieser Mutagene werden auf genetisch homogenes Saatgut und vegetativ vermehrtes Pflanzenmaterial untersucht.,Spezifische Hauptziele sind:
- Bestimmung der Mechanismen und des Gesamtschadens der DNA – Schädigung bei der M1-Generation, z. B. direkt in behandeltem Saatgut in Vor-und Nachkeimungstests.
- Bestimmung von Typen, Frequenzen, Raten und Mustern von Mutationen in M2-Generationen, über (a) ganze Genome und (b) in gezielten DNA-Sequenzen innerhalb von Genomen.
- Bestimmung der Art und der Rate der spontanen Mutation über Generationen in wichtigen Pflanzengruppen (z. B. ein ausgewähltes Pflanzensystem, um die spontane Rate als Basislinie und als inhärenten Indikator für die Mutagenität des Genotyps zu bestimmen).,
- Erstellung von Protokollen und Richtlinien für die Verwendung bestimmter Mutagene für eine Reihe spezifischer Anwendungen in der Pflanzenverbesserung und Genomik.
- Bestimmung der chemischen und molekularen Basis für die differentielle Strahlenempfindlichkeit bei verschiedenen Sorten derselben Pflanzenart.
- Quantifizierung der Art und Rate der spontanen Baseline-Mutation unter Verwendung von Mutationsakkumulationsexperimenten mit mehreren Generationen.
Teilnehmer:
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Projektbeauftragter:
P. J. L. Lagoda