16S rybosomalne RNA

Gen 16S rRNA jest używany do badań filogenetycznych, ponieważ jest wysoce zachowany między różnymi gatunkami bakterii i archeea. Carl Woese (1977) był pionierem tego wykorzystania 16S rRNA. Sugeruje się, że Gen 16S rRNA może być używany jako niezawodny zegar molekularny, ponieważ sekwencje 16S rRNA z odległych spokrewnionych linii bakteryjnych wykazują podobną funkcjonalność. Niektóre termofilne archeea (np. rzędu Termoproteales) zawierają introny genu 16S rRNA, które znajdują się w wysoce konserwowanych regionach i mogą wpływać na wyżarzanie „uniwersalnych” primerów., Wzmacnia się również mitochondrialny i chloroplastyczny rRNA.

najpopularniejsza para podkładów została opracowana przez Weisburg et al. (1991) i jest obecnie określany jako 27F i 1492r; jednak w niektórych zastosowaniach konieczne może być krótsze amplikony, na przykład dla sekwencjonowania 454 z chemią tytanu para podkładu 27F-534r pokrywająca V1 do V3.Często używa się 8F zamiast 27F. dwa primery są prawie identyczne, ale 27F ma M zamiast C. agagtttgatcmtggctcag w porównaniu z 8F.,

PCR and NGS applicationsEdit

In addition to highly conserved primer binding sites, 16S rRNA gene sequences contain hypervariable regions that can provide species-specific signature sequences useful for identification of bacteria.,W rezultacie sekwencjonowanie genu 16S rRNA stało się powszechne w mikrobiologii medycznej jako szybka i tania alternatywa dla fenotypowych metod identyfikacji bakterii. Chociaż pierwotnie był używany do identyfikacji bakterii, sekwencjonowanie 16S okazało się później zdolne do przeklasyfikowania bakterii do zupełnie nowych gatunków, a nawet genera.It został również użyty do opisania nowych gatunków, które nigdy nie zostały pomyślnie wyhodowane.,Z trzeciej generacji sekwencjonowania pochodzących do wielu laboratoriów, jednoczesna identyfikacja tysięcy 16S sekwencji rRNA jest możliwe w ciągu godzin, umożliwiając badania metagenomic, na przykład flory jelitowej.

hiperwariable regionsEdit

bakteryjny Gen 16S zawiera dziewięć hiperwariable regions (V1–V9), o długości od około 30 do 100 par zasad, które są zaangażowane w drugorzędową strukturę podjednostki rybosomalnej., Stopień ochrony jest bardzo zróżnicowany w zależności od regionu, z bardziej zachowanymi regionami korelującymi z taksonomią wyższego poziomu, a mniej zachowanymi regionami z niższymi poziomami, takimi jak rodzaj i gatunek. Podczas gdy cała sekwencja 16S pozwala na porównanie wszystkich hiperwariowalnych regionów, przy długości około 1500 par zasad może być zbyt kosztowna dla badań mających na celu identyfikację lub scharakteryzowanie różnych społeczności bakteryjnych., Badania te powszechnie wykorzystują platformę Illumina, która produkuje odczyty w tempie 50-krotnie i 12 000-krotnie tańszym niż odpowiednio 454 sekwencjonowanie pyrosequencing i Sanger. Podczas gdy tańsze i pozwalające na głębsze pokrycie społeczności, sekwencjonowanie Illumina produkuje tylko odczyty 75-250 par zasad długich (do 300 par bazowych z Illumina MiSeq) i nie ma ustalonego protokołu niezawodnego montażu pełnego genu w próbkach społeczności. Pełne obszary hipermienne mogą być montowane z jednego biegu Illumina, co czyni je idealnymi celami dla platformy.,

podczas gdy regiony hiperwariable 16S mogą się znacznie różnić między bakteriami, Gen 16S jako całość zachowuje większą jednorodność długości niż jego eukariotyczny odpowiednik (rybosomalny RNA 18S), co może ułatwić wyrównanie. Dodatkowo, Gen 16S zawiera wysoce zachowane sekwencje między hiperwariowalnymi regionami, umożliwiając projektowanie uniwersalnych primerów, które mogą niezawodnie produkować te same sekcje sekwencji 16S w różnych taksonach. Chociaż żaden hiperwariowalny region nie może dokładnie sklasyfikować wszystkich bakterii z domeny do gatunku, niektóre mogą wiarygodnie przewidzieć określone poziomy taksonomiczne., Wiele badań społeczności wybrać częściowo zachowane hiperwariable regionów jak V4 z tego powodu, jak to może zapewnić rozdzielczość na poziomie filum tak dokładnie, jak gen 16S pełny. Podczas gdy mniej chronione regiony walczą o klasyfikację nowych gatunków, gdy Taksonomia wyższego rzędu nie jest znana, są one często używane do wykrywania obecności określonych patogenów. W jednym z badań Chakravorty et al. w 2007 r. autorzy scharakteryzowali regiony V1–V8 różnych patogenów w celu określenia, które regiony hiperwariowalne byłyby najbardziej użyteczne dla specyficznych dla choroby i szerokich testów., Wśród innych ustaleń zauważyli, że region V3 był najlepszy w identyfikacji rodzaju dla wszystkich badanych patogenów, a V6 był najdokładniejszy w rozróżnianiu gatunków pomiędzy wszystkimi badanymi patogenami CDC, w tym wąglikiem.

podczas gdy 16S hyperwariable region analysis jest potężnym narzędziem do badań taksonomicznych bakterii, trudno jest odróżnić blisko spokrewnione gatunki. W rodzinach Enterobacteriaceae, Clostridiaceae i Peptostreptococcaceae, gatunki mogą mieć do 99% podobieństwa sekwencji w całym Genie 16S., W rezultacie sekwencje V4 mogą różnić się tylko o kilka nukleotydów, co sprawia, że bazy danych referencyjnych nie są w stanie wiarygodnie sklasyfikować tych bakterii na niższych poziomach taksonomicznych. Ograniczając analizę 16S do wyboru regionów hipermiennych, badania te mogą nie zauważyć różnic w blisko spokrewnionych taksonach i zgrupować je w pojedyncze jednostki taksonomiczne, dlatego nie doceniając całkowitej różnorodności próbki. Ponadto genomy bakteryjne mogą zawierać wiele genów 16S, z regionami V1, V2 i V6 zawierającymi największą różnorodność wewnątrzgatunkową., Chociaż nie jest to najbardziej precyzyjna metoda klasyfikacji gatunków bakterii, analiza hiperwariowalnych regionów pozostaje jednym z najbardziej użytecznych narzędzi dostępnych do badań społeczności bakteryjnej.