różnicowa migracja Holo-i apo – metaloprotein przez mikrofon-BN-PAGE
podczas gdy nie zaobserwowano separacji holo-(Fe2 – transferryny (TF)) i apo-TF w konwencjonalnych badaniach 1D Native (CBB g-250 Free)-strona (rys. 1a) i SDS-PAGE (rys., 1b), co ciekawe, okazało się, że holo – i apo-tf są całkowicie oddzielone za pomocą mikrofonu-BN-PAGE (rys. 1c) (należy zauważyć, że zaobserwowano dwa pasma dla” czystej ” próbki apo-TF wykorzystującej stronę BN bez trybu mikrofonu z powodu zanieczyszczenia jonami metali; dodatkowe rys. S1). W SDS-PAGE wynika to prawdopodobnie z dysocjacji jonów metali z holo-form zachodzących w warunkach silnego denaturacji14, 15 (dane nie pokazano). Fakt ten sugeruje, że elektroforetyczne rozpoznawanie holo-i apo-form nie jest dostępne dla konwencjonalnych metod PAGE., Wyniki te sugerują, że specyficzne słabe środki denaturujące, takie jak CBB-G 250 stosowane w mikrofonie BN-PAGE, rozpoznają różnicę między Holo-i apo-metaloproteinami w celu zwiększenia separacji, oprócz uniknięcia dysocjacji metalu.
różne zachowania migracyjne dla holo – i apo-form zaobserwowano również dla ceruloplazminy (CP) związanej z Cu2+ (Cu-Cp) i dysmutazy ponadtlenkowej (SOD) związanej z Cu2+ i Zn2+ (Cu / Zn-SOD) metodą MICS-BN-PAGE (rys. 1d, e). Apo-formy migrowane do pozycji w ścisłej korespondencji z ich dokładnych wag molekularnych w MIC-BN-strona (rys., 1: Tf, 77 kDa; Cp, 134 KDA; SOD, 32 kDa), co jest przydatne przy identyfikacji białek. Jak opisano w sekcji Wprowadzenie, wyniki te doprowadziły nas do opracowania metodologii holo / apo conversion (HAC)-2D MICS-BN-PAGE do selektywnej izolacji holo-metaloprotein.
koncepcja konwersji holo/apo 2D MICS-BN-PAGE
nasza nowa metoda 2D PAGE oparta na migracji różnicowej pomiędzy Holo – i apo-metaloproteinami, rozpoczyna się etapem mikrofon-BN-PAGE przeprowadzonym w dwóch torach (pasy a i B na Rys., 2, panel I), aby umożliwić oddzielenie holo-i apo-metaloprotein od próbki zawierającej obie formy metaloprotein. Dwa pasy są następnie poddawane dwóm różnym zabiegom po początkowym rozdzieleniu strony mikrofonu-BN: pas a jest poddawany drugiemu etapowi mikrofonu-BN-PAGE, ale dopiero po przejściu leczenia konwersji holo / apo (rys. 2 panel II-1); Podczas gdy Lane B jest dostarczany do etapu strony wykrywania metali w celu określenia jonów metali związanych z oddzielonymi białkami (rys. 2 panel II-2). Leczenie stosowane w pasie B zostało wcześniej zatwierdzone., Na przykład opisano oznaczanie niektórych jonów metali ciężkich (Cu2+, Fe3+, Co3+, Ni2+, Mn2+ i Cd2+) w próbkach o małej objętości (µL) na poziomie ppt i poniżej ppb przy użyciu niniejszej metody PAGE bez użycia pomieszczenia czystego21. Co więcej, metodologia tandem 1D MICS-BN-PAGE / metal detection page ujawniła dokładny rozkład Cu2+ w surowicy ludzkiej nawet w przypadku słabo związanego albuminą (wymiennego) Cu2+ 21 i zasugerowała, że peryplazmiczne białko Rubrivivax gelatinosus CopI silnie zaangażowane w oporność miedzi jest białkiem wiążącym miedzię22., Mimo to, aby całkowicie zidentyfikować białka związane z metalem w złożonej próbce białka jest trudne z powodu Ko-migrujących białek. Na przykład nie zostało w pełni udowodnione, że CopI jest białkiem wiążącym miedź w R. gelatinosus, chociaż jego sekwencja ma trzy przypuszczalne miejsca wiązania Cu: (i) centrum miedzi typu 1 obecne w wielu miedzioksynach, takich jak azuryna i plastocyjanina, (ii) Sekwencja N-końcowa bogata w histydynę i (iii) Sekwencja bogata w histydynę/metioninę. Białka związane z CopI są obecne w wielu bakteriach, ale nie są szeroko konserwowane; na przykład jest nieobecny w Escherichia coli22., Do tej pory badano tylko białka R. gelatinosus i Vibrio cholerae i biorą udział w oporności Cu 22,23. U R. gelatinosus białko CopI ulega wysokiej ekspresji w obecności Cu2+, jednak mechanizm detoksykacji Cu jest nadal nieznany. W związku z tym konieczna jest metoda izolacji metaloprotein ze wszystkich innych białek współistniejących w złożonych próbkach biologicznych.
koncepcja metodologii HAC-2D MICS-BN-PAGE / metal detection PAGE., Panel I: mikrofony 1D-strona BN w dwóch torach. Pas a poddano in-gel konwersji holo / apo (jak w Panelu II-1), a następnie pas a poddano 2D MICS-BN-PAGE po konwersji holo/apo (jak w Panelu III). Pas B został poddany stronie detekcji Cu2 + i Fe3 + (jak w Panelu II-2). Elektroferogram 2D jest mieszaniną metaloprotein (holo-TF, apo-TF, holo-Cp i holo-SOD), w której holo-metaloproteiny w oryginalnej próbce zostały wyizolowane jako plamy od linii ukośnej (kropkowana żółta linia w Panelu III). Pełnowymiarowe wersje elektroferogramów przedstawione na Rys., 2 są przedstawione na Rys. / S2
aby przezwyciężyć to ograniczenie, informacje dostarczane przez 1D mikrofon-BN-PAGE/analiza strony wykrywania metali w pasie B jest rozszerzana poprzez poddanie pasa a drugiemu wymiarowi mikrofon-BN-PAGE po konwersji holo / apo. Aby przeprowadzić tę analizę, pas a jest najpierw moczony w kwaśnym roztworze chelatora metali (patrz sekcja Metody i dodatkowe szczegółowe warunki) do konwersji holo / apo (rys. 2 panel II-1)., W ten sposób holo-metaloproteiny są derywatyzowane w wolne od metali apo-metaloproteiny w żelu pierwszego wymiaru strony. Oczyszczony pas a jest następnie dostarczany do drugiego etapu mikrofonu-strony BN za pomocą niezawierającego metali żelu agarozowego (zob. Informacje uzupełniające). W drugim etapie mikrofon-BN-PAGE (rys. 2, panel III), apo-metaloproteiny i niemetaloproteiny z oryginalnej próbki migrują po linii diagonalnej, ponieważ migracja tych gatunków w wymiarze drugiej strony jest całkowicie identyczna z ich migracją w wymiarze pierwszej strony., Z drugiej strony, holo-metaloproteiny z oryginalnej próbki migrują w różnych odległościach w pierwszym i drugim wymiarze miks-BN-PAGE, ponieważ białka te migrują jako ich holo-formy w pierwszym wymiarze i jako ich apo-formy w drugim wymiarze (a ponieważ miks-BN-PAGE powoduje inną mobilność elektroforetyczną dla holo – i apo-form metaloprotein; vide infra). Tak więc tylko Holo-metaloproteiny z oryginalnej próbki migrują z linii diagonalnej w drugim wymiarze, aby zostać zidentyfikowane przez MALDI-TOF MS bez dodatkowego oczyszczania białek., Rodzaje i ilości jonów metali związanych z metaloproteinami w oryginalnym roztworze próbki (wyizolowanych jako plamy poza przekątną) można określić na stronie wykrywania metali w pasie B, jak opisano powyżej. W związku z tym informacje dotyczące identyfikacji i dystrybucji gatunków metaloprotein, wraz z tożsamościami i stężeniami jonów metali, które wiążą, są dostępne z tej nowej metodologii HAC-2D MICS-BN-PAGE/metal detection PAGE.,
selektywna izolacja metaloprotein w HAC-2D MICS-BN-PAGE
dla proof-of-concept, hac-2D MICS-BN-PAGE / metal detection PAGE została zademonstrowana dla próbki mieszaniny zawierającej standardy białek holo-TF, apo-TF, holo-Cp i Holo-SOD (w wyniku czego wykonano elektroferogram 2D na Rys. 2, panel III), a także dla próbki surowicy ludzkiej (rys. S3). Plamy Holo-metaloprotein, które migrowały poza linię diagonalną, zostały z powodzeniem zaobserwowane w próbce mieszanego białka., Ponadto Fe3 + wykryto w pozycji holo-TF, a Cu2 + w pozycji holo-Cp i holo-SOD, w pierwszej fazie mikrofonu BN-PAGE za pomocą strony wykrywania metali. Jeśli nie zostanie przeprowadzona konwersja holo / apo, wszystkie białka migrują na linii diagonalnej (rys. S5). W przypadku ludzkiej próbki surowicy z powodzeniem wykryto holo-Tf i holo-Cp (rys. S3)., W związku z tym stwierdzono, że strona HAC-2D MICS-BN-PAGE/metal detection PAGE jest bardzo skuteczna w izolacji holo-metaloprotein i identyfikacji jonów metali pierwotnie związanych z metaloproteinami w mieszaninie białek.
na koniec metoda HAC-2D MICS-BN-PAGE została zastosowana do całkowitej bakteryjnej rozpuszczalnej frakcji białkowej otrzymanej z komórek R. gelatinosus wyhodowanych w obecności 1,2 mm Cu2+, wyrażającej białko CopI. Stanowi to biologiczną próbkę białka., Dla tej próbki, punkt poza linią ukośną został znaleziony w pozycji 100 kDa i 29 kDa na pierwszej i drugiej stronie, odpowiednio (rys. 3a). Wysokie stężenie Cu2 + zaobserwowano w pozycji 97-139 kDa na pierwszej stronie MIC-BN (rys. 3b). W związku z tym stwierdzono, że białko w tym miejscu wiąże się z Jonem Cu. Plamka została wycięta, a następnie przeanalizowana przez MALDI-TOF MS. zidentyfikowano peptydy odpowiadające CopI(rys. 3c, rys. uzupełniający S7 i Stół S1)., Ponadto, gdy ten punkt żelu był badany na stronie SDS, zaobserwowano pojedyncze pasmo białka CopI (dane nie pokazano). Kolejną plamę poza linią ukośną zaobserwowano przy około 40 kDa (powyżej 29 kDa plamki CopI w drugim wymiarze (rys. 3a)). MALDI-TOF MS potwierdził, że ta plamka również pochodzi z CopI (i prawdopodobnie była dimerem CopI zgodnie z masą cząsteczkową). W ten sposób metaloproteina może być specjalnie wyizolowana ze złożonej mieszaniny białek, jednocześnie identyfikując swój związany metal., Ta analiza HAC-2D MICS-BN-PAGE zdecydowanie udowodniła, że CopI jest białkiem wiążącym miedź i co ciekawe, że ta właściwość może być związana z funkcją detoksykacji cu białka w bakteryjnej peryplazmie. Dalsza analiza ilościowa wykazała stechiometrię jonu Cu do CopI w stosunku 1:1 (na podstawie stężeń związanego jonu Cu (1,05 µM) i białka holo-CopI (0,95 µM), oznaczonego barwieniem CBB R-250). Jest to całkowicie zgodne z innymi wynikami eksperymentalnymi, które wykazały stechiometrię cu:CopI 1: 1.2 przy użyciu ICP-MS z czystym CopI (Durand et al.,, niepublikowane dane). Wynik ten sugeruje, że nasza metoda jest również przydatna do badań stechiometrii metaloprotein.
HAC-2D MICS-BN-strona wykorzystująca barwienie srebrem (a), ze stroną wykrywania Cu2+ (b), frakcji rozpuszczalnej otrzymanej z R. komórki gelatinosus uprawiane w obecności 1,2 mm CU2+ (białko całkowite: 31,5 µg). Miejsce poza przekątną wskazywane gwiazdką w (a) zostało poddane MALDI-TOF MS (dodatkowe rys., S7), identyfikując sekwencje pokazane czerwoną czcionką jako część sekwencji CopI (c). Pełnowymiarowe wersje elektroferogramów przedstawione na Rys. 3 są przedstawione na dodatkowym rys. S8.
eksperymenty elektroforezy kapilarnej w celu zbadania trybów rozpoznawania molekularnego
poprawa rozdzielczości między holo – i APO-formami w mikrofonach-strona wspomagana barwnikiem CBB (rys., 1c-e) jest ważnym kluczem do naszej metodologii i, co ciekawe, to rozpoznawanie molekularne wydaje się pochodzić z różnych ilości cząsteczek barwnika CBB G-250 wiążących się z każdą z holo-vs. apo-form metaloprotein. To z kolei prawdopodobnie skutkuje różnymi efektywnymi ładunkami i / lub indukowanymi strukturami sterycznymi dla kompleksów białkowo-barwnikowych. Oba te efekty miałyby wpływ na mobilność elektroforetyczną., Aby uzyskać głębszy wgląd w mechanizm rozpoznawania wiązania barwnika CBB G-250 w kierunku holo – i apo-TF, przeprowadzono eksperymenty CE wraz z symulacjami dokowania przy użyciu programu AutoDock Vina 24 ,25 (vide infra). CZE jest przeprowadzany w wolnym roztworze wodnym bez matrycy żelowej, a więc efekt przesiewania molekularnego nie musi być brany pod uwagę w symulacjach. Mobilność elektroforetyczna holo-TF mierzona przez CZE była oczywiście inna niż w przypadku apo-TF z dodatkiem barwnika CBB (rys. 4), podczas gdy białka te miały identyczną mobilność w przypadku braku barwnika., Fakt ten zdecydowanie sugeruje, że liczba cząsteczek barwnika związanych z Holo – i apo-metaloproteinami jest różna. W CZE, na migrację kompleksu białkowo-barwnikowego wpływałby głównie ładunek efektywny kompleksu, na który z kolei wpływałaby liczba pojedynczo naładowanych anionowych cząsteczek barwnika CBB związanych z białkiem.,
typowe elektroferogramy z eksperymentów CZE dla: 10 µM holo – lub apo-TF bez CBB G-250 (górny zielony ślad); oraz mieszaniny zawierające barwnik 5 mm CBB g-250 z 10 µm Holo-TF (środkowy niebieski ślad) lub 10 µm APO-tf (Dolny czerwony ślad).,
tradycyjnie mobilność elektroforetyczna białka w wolnym roztworze jest reprezentowana przez równanie Henry ' ego, jak pokazano w równaniu (1):
q, η, r i K reprezentują ładunek netto, lepkość roztworu, promień białka i odwrotną długość roztworu elektrolitu. Funkcja Henry ' ego, H, zwiększa się monotonicznie z 2/3 do 1., Ściśle mówiąc, ten wzór dotyczy wyłącznie sferycznej cząsteczki o centrosymetrycznym rozkładzie ładunku, chociaż istnieją pewne dyskusje, aby zmodyfikować równanie Henry ' ego tak, aby miało zastosowanie do nie-sferycznych białek o złożonym rozkładzie ładunku (włączając dipol i kwadrupol)26. W naszym przypadku cząsteczki holo – i apo-tf są zdeformowanymi sferami o bardzo podobnej wielkości (przypominającymi sferoidy o długościach długich i krótkich osi odpowiednio około 92 i 60 Å (holo-TF) oraz 93 i 68 Å (apo-TF)) (ilustr. S9)., Ponadto oczekuje się, że dipol i kwadrupol będą miały tylko niewielki wpływ na mobilność, ponieważ cząsteczki CBB G-250 związane z holo-/apo-TF nie są zlokalizowane, jak pokazano na dodatkowym rysunku. S9 (patrz niżej). Wyniki precyzyjnych obliczeń Kim i wsp.26 pokazują, że na mobilność elektroforetyczną białka sferoidalnego kwadrupol nie ma istotnego wpływu w roztworach o niskiej sile jonowej (I < 0,01 M), a siła jonowa bufora separacyjnego w naszych eksperymentach CZE była podobnie niska (i = 0,013 M).,
tak więc stosunek elektroforetycznych mobili APO-i holo-TF skompleksowanych barwnikiem CBB G-250 (czyli µApo/µHolo) przypisuje się stosunkowi opłat netto każdego kompleksu (mianowicie QApo/QHolo), który można łatwo uzyskać z równania Henry ' ego. Ujemne opłaty netto kompleksów TF-CBB G-250 pochodzą głównie z numeru wiążącego barwnika. W konsekwencji wartość µApo / µHolo daje również stosunek liczby barwników (mianowicie NApo / nholo). Eksperymentalnie, stosunek mobilności elektroforetycznej dwóch form Tf (µApo/µHolo = (-2.69 × 10-4)/(-2.,09 × 10-4)) została uznana za 1,29 Przez CZE (rys. 4), co odpowiada stosunkowi efektywnego ładunku elektrycznego, pod warunkiem, że rozmiary obu form Tf są podobne. Stąd stosunek mobilizacji elektroforetycznej powinien zgadzać się ze stosunkiem wiązanych cząsteczek barwnika. Jednak dalsze omówienie zależności między mobilnością elektroforetyczną a kształtem białka dla innych metaloprotein jest potrzebne w przypadkach, gdy kształty holo – i apo-białka różnią się (jak dla Cp).,
Symulacja dokowania molekularnego eksperymenty w celu zbadania trybów rozpoznawania molekularnego
Wiązanie barwnika zostało określone przez elastyczne symulacje dokowania molekularnego AutoDock Vina27, mające na celu wyczerpujące wyszukiwanie miejsc wiązania i obliczanie ich wolnych energii (rys. 5 i dodatkowe rys. S9). Ostatnio Wang et al.25 poinformował, że AutoDock Vina ma wysoką moc punktacji i pośrednią moc próbkowania w porównaniu z innymi powszechnie używanymi programami dokującymi., Zgodnie z tymi symulacjami, większa liczba cząsteczek barwnika CBB G-250 związanych z pustymi miejscami wiązania Fe w apo-TF w porównaniu do holo-TF (rys. 5a). Na podstawie tych symulacji Autodock Vina stwierdzono, że stosunek liczby wiązania barwnika NApo / NHolo wynosi 1,23, przy energii wiązania <-6,5 kcal/mol (co odpowiada K~104,4 M−1) (rys. 5b dla liczby wiązania barwnika skumulowany rozkład częstotliwości jako funkcja energii wiązania), co jest w dobrej zgodzie z naszymi Wynikami CZE, omówionymi wcześniej(NApo / NHolo = 1.29)., Zakłada się ilościowe wiązanie z dodatkiem barwnika na poziomie mM (ponad 95% miejsc wiązania wchodzi w interakcję z barwnikiem, gdy log K wynosi 4,4 lub więcej), jak w tych doświadczeniach.
liczba wiązań cząsteczek barwnika z holo-TF była również badana w eksperymentach CZE (dane nie pokazano), ocenianych na podstawie spadku wolnego piku barwnika dla próbki barwnika 1 mM CBB G-250 z dodatkiem i bez dodatku 10 µM holo-TF., Ponieważ liczba wiązań została zmierzona na >18, liczba wiązań NHolo została uznana za > 20 w eksperymentach na stronie MICS-BN (z dodatkiem barwnika 3,0 mM). Ta wiążąca liczba cząsteczek barwnika (>20) z eksperymentów CZE jest w dobrej zgodzie z liczbą związanych cząsteczek barwnika (N = 21) z symulacji dokowania molekularnego, które dałyby początek przewidywanemu powinowactwu -6,5 kcal/mol, a więc nasze wyniki są spójne.,
z symulacji molekularnych i eksperymentów CZE wynika, że barwnik CBB G-250 rozpoznaje różne struktury chemiczne Holo – i apo-metaloprotein, dając różne wartości µ. Bardziej szczegółowe obserwacje symulowanych trybów wiązania sugerują również, że cząsteczka CBB G-250 oddziałuje z pozostałościami aminokwasowymi dostępnymi ze względu na bardziej otwartą (rozwiniętą) strukturę apo-TF w porównaniu z bardziej zamkniętą (złożoną) strukturą holo-TF, podczas gdy barwnik nie wykazuje bezpośredniego wiązania z resztami aminokwasowymi wiążącymi Fe (Asp392, Tyr429, Tyr517 i His 585)., Oznacza to, że barwnik rozpoznaje niewielkie różnice między złożonymi i rozłożonymi strukturami chemicznymi metaloprotein, które są indukowane przez wiązanie lub dysocjację jonów metali. Tak małych różnic nie można zidentyfikować za pomocą żadnych innych konwencjonalnych metod separacji.
pozostałości aminokwasów kontaktujące się z cząsteczką barwnika w każdym miejscu wiązania barwnika w symulacji (na przykład dodatkowe rys. S10) zostały sklasyfikowane według ich dominującego charakteru: ładunek hydrofobowy, hydrofilowy lub elektrostatyczny (jak podsumowano w tabeli dodatkowej S2 i tabeli S3)., Zgodnie z wynikami populacje każdego rodzaju aminokwasów oddziałujących z cząsteczkami barwnika nie wykazywały różnicy między formami holo-i apo-białkowymi (26-27% dla hydrofobowych, 37-40% dla hydrofilowych, 33-35% dla naładowanych reszt w każdej postaci). Jednak liczba wiązań wodorowych w apo-Tf (33 ogółem; 1,2 na miejsce wiązania) była znacznie większa niż w holo-TF (19 ogółem; 0,9 na miejsce wiązania). Skupiając się na ośmiu miejscach wiązania w apo – Tf, które nie były obecne w holo-TF (tabela uzupełniająca S3), stwierdzono, że liczba wiązań H na miejsce wynosi 2,1., Wyniki te silnie sugerują, że zmiany w oddziaływaniach wiązań wodorowych są przede wszystkim odpowiedzialne za rozróżnienie między formami holo – i apo-Tf, podczas gdy dalsze badania byłyby potrzebne do zrozumienia całego mechanizmu.