różnicowa migracja Holo-i apo – metaloprotein przez mikrofon-BN-PAGE
podczas gdy nie zaobserwowano separacji holo-(Fe2 – transferryny (TF)) i apo-TF w konwencjonalnych badaniach 1D Native (CBB g-250 Free)-strona (rys. 1a) i SDS-PAGE (rys., 1b), co ciekawe, okazało się, że holo – i apo-tf są całkowicie oddzielone za pomocą mikrofonu-BN-PAGE (rys. 1c) (należy zauważyć, że zaobserwowano dwa pasma dla” czystej ” próbki apo-TF wykorzystującej stronę BN bez trybu mikrofonu z powodu zanieczyszczenia jonami metali; dodatkowe rys. S1). W SDS-PAGE wynika to prawdopodobnie z dysocjacji jonów metali z holo-form zachodzących w warunkach silnego denaturacji14, 15 (dane nie pokazano). Fakt ten sugeruje, że elektroforetyczne rozpoznawanie holo-i apo-form nie jest dostępne dla konwencjonalnych metod PAGE., Wyniki te sugerują, że specyficzne słabe środki denaturujące, takie jak CBB-G 250 stosowane w mikrofonie BN-PAGE, rozpoznają różnicę między Holo-i apo-metaloproteinami w celu zwiększenia separacji, oprócz uniknięcia dysocjacji metalu.
różne zachowania migracyjne dla holo – i apo-form zaobserwowano również dla ceruloplazminy (CP) związanej z Cu2+ (Cu-Cp) i dysmutazy ponadtlenkowej (SOD) związanej z Cu2+ i Zn2+ (Cu / Zn-SOD) metodą MICS-BN-PAGE (rys. 1d, e). Apo-formy migrowane do pozycji w ścisłej korespondencji z ich dokładnych wag molekularnych w MIC-BN-strona (rys., 1: Tf, 77 kDa; Cp, 134 KDA; SOD, 32 kDa), co jest przydatne przy identyfikacji białek. Jak opisano w sekcji Wprowadzenie, wyniki te doprowadziły nas do opracowania metodologii holo / apo conversion (HAC)-2D MICS-BN-PAGE do selektywnej izolacji holo-metaloprotein.
koncepcja konwersji holo/apo 2D MICS-BN-PAGE
nasza nowa metoda 2D PAGE oparta na migracji różnicowej pomiędzy Holo – i apo-metaloproteinami, rozpoczyna się etapem mikrofon-BN-PAGE przeprowadzonym w dwóch torach (pasy a i B na Rys., 2, panel I), aby umożliwić oddzielenie holo-i apo-metaloprotein od próbki zawierającej obie formy metaloprotein. Dwa pasy są następnie poddawane dwóm różnym zabiegom po początkowym rozdzieleniu strony mikrofonu-BN: pas a jest poddawany drugiemu etapowi mikrofonu-BN-PAGE, ale dopiero po przejściu leczenia konwersji holo / apo (rys. 2 panel II-1); Podczas gdy Lane B jest dostarczany do etapu strony wykrywania metali w celu określenia jonów metali związanych z oddzielonymi białkami (rys. 2 panel II-2). Leczenie stosowane w pasie B zostało wcześniej zatwierdzone., Na przykład opisano oznaczanie niektórych jonów metali ciężkich (Cu2+, Fe3+, Co3+, Ni2+, Mn2+ i Cd2+) w próbkach o małej objętości (µL) na poziomie ppt i poniżej ppb przy użyciu niniejszej metody PAGE bez użycia pomieszczenia czystego21. Co więcej, metodologia tandem 1D MICS-BN-PAGE / metal detection page ujawniła dokładny rozkład Cu2+ w surowicy ludzkiej nawet w przypadku słabo związanego albuminą (wymiennego) Cu2+ 21 i zasugerowała, że peryplazmiczne białko Rubrivivax gelatinosus CopI silnie zaangażowane w oporność miedzi jest białkiem wiążącym miedzię22., Mimo to, aby całkowicie zidentyfikować białka związane z metalem w złożonej próbce białka jest trudne z powodu Ko-migrujących białek. Na przykład nie zostało w pełni udowodnione, że CopI jest białkiem wiążącym miedź w R. gelatinosus, chociaż jego sekwencja ma trzy przypuszczalne miejsca wiązania Cu: (i) centrum miedzi typu 1 obecne w wielu miedzioksynach, takich jak azuryna i plastocyjanina, (ii) Sekwencja N-końcowa bogata w histydynę i (iii) Sekwencja bogata w histydynę/metioninę. Białka związane z CopI są obecne w wielu bakteriach, ale nie są szeroko konserwowane; na przykład jest nieobecny w Escherichia coli22., Do tej pory badano tylko białka R. gelatinosus i Vibrio cholerae i biorą udział w oporności Cu 22,23. U R. gelatinosus białko CopI ulega wysokiej ekspresji w obecności Cu2+, jednak mechanizm detoksykacji Cu jest nadal nieznany. W związku z tym konieczna jest metoda izolacji metaloprotein ze wszystkich innych białek współistniejących w złożonych próbkach biologicznych.