rozwój, różnicowanie i wzrost komórek i tkanek wymaga precyzyjnie regulowanych wzorców ekspresji genów. Enhancers pracować jako cis-regulator element pośredniczy zarówno przestrzenny i czasowy Kontrola rozwój włączać transkrybowanie w specyficznych komórkach i / lub tłumić ono w innych komórkach. Tak więc, szczególna kombinacja czynników transkrypcyjnych i innych białek wiążących DNA w rozwijającej się tkance kontroluje które geny będą wyrażane w tej tkance. Enhancers pozwolić ten sam gen używać w różnorodny proces w przestrzeni i czasie.,
identyfikacja i charakteryzacjaedytuj
tradycyjnie enhancery identyfikowano za pomocą technik Enhancer trap wykorzystujących Gen reporterski lub poprzez porównawczą analizę sekwencji i genomikę obliczeniową. W genetycznie tracable modelach tak jak owocowy Muchówka Drosophila melanogaster, na przykład, reporterowy konstruować tak jak Lacz gen może losowo integrować w genomie używać p element transposon. Jeśli Gen reportera integruje się w pobliżu wzmacniacza, jego ekspresja będzie odzwierciedlać wzór ekspresji napędzany przez tego wzmacniacza., Tak więc zabarwienie much dla ekspresji lub aktywności lacza i klonowanie sekwencji otaczającej miejsce integracji pozwala na identyfikację sekwencji wzmacniacza.
rozwój technologii genomicznych i epigenomicznych radykalnie zmienił perspektywy odkrywania modułów cis-regulacyjnych (CRM)., Metody sekwencjonowania nowej generacji (NGS) umożliwiają teraz wysokoprzepustowe funkcjonalne testy CRM discovery, a znacznie rosnące ilości dostępnych danych, w tym wielkoskalowe biblioteki motywów wiążących czynnik transkrypcyjny (TFBS), zbiory adnotowanych, zwalidowanych CRM i rozległe dane epigenetyczne w wielu typach komórek, czynią dokładne obliczeniowe odkrycie CRM osiągalnym celem. Przykład podejścia opartego na NGS o nazwie DNase-seq umożliwił identyfikację zubożonych nukleosomów lub otwartych regionów chromatyny, które mogą zawierać CRM., Niedawno opracowano techniki takie jak ATAC-seq, które wymagają mniej materiału wyjściowego. Nucelosome zubożone regiony mogą utożsamiać in vivo poprzez ekspresję Dam methylase, pozwalający dla większej kontroli specyficznego enhancer identyfikacji typ komórki.Metody obliczeniowe obejmują genomikę porównawczą, grupowanie znanych lub przewidywanych miejsc wiązania TF i nadzorowane podejścia uczenia maszynowego przeszkolone na znanych CRM., Wszystkie te metody okazały się skuteczne dla CRM discovery, ale każdy ma swoje własne rozważania i ograniczenia, a każdy jest przedmiotem większej lub mniejszej liczby fałszywie dodatnie identifications.In podejście porównawcze genomiki, zachowanie sekwencji niekodujących regionów może być wskaźnikiem wzmacniaczy. Sekwencje z wielu gatunków są wyrównane, a zachowane regiony są identyfikowane obliczeniowo., Zidentyfikowane sekwencje mogą być dołączone do genu reporterskiego, takiego jak zielone fluorescencyjne białko lub Lacz, aby określić in vivo wzór ekspresji genu wytwarzanego przez wzmacniacz po wstrzyknięciu do zarodka. ekspresja mRNA reportera może być wizualizowana przez hybrydyzację in situ, która zapewnia bardziej bezpośredni pomiar aktywności wzmacniacza, ponieważ nie jest poddawana złożoności translacji i fałdowania białek., Chociaż wiele dowodów wskazuje na zachowanie sekwencji dla krytycznych wzmacniaczy rozwoju, inne prace wykazały, że funkcja wzmacniaczy może być zachowana przy niewielkiej lub żadnej pierwotnej konserwacji sekwencji. Na przykład, wzmacniacze RET u ludzi mają bardzo mało zachowania sekwencji do tych w danio pręgowanym, ale sekwencje obu gatunków wytwarzają prawie identyczne wzorce reporterskiej ekspresji genu w danio pręgowanym., Podobnie, u wysoce zróżnicowanych owadów (rozdzielonych przez około 350 milionów lat), podobne wzorce ekspresji genów kilku kluczowych genów zostały uznane za regulowane przez podobnie uformowane CRM, chociaż te CRM nie wykazują żadnej znaczącej ochrony sekwencji wykrywalnej za pomocą standardowych metod wyrównywania sekwencji, takich jak BLAST.
w segmentacji insektów
wzmacniacze determinujące wczesną segmentację zarodków Drosophila melanogaster należą do najlepiej scharakteryzowanych wzmacniaczy rozwojowych., We wczesnym zarodku muchowym czynniki transkrypcyjne genów gap są odpowiedzialne za aktywację i represjonowanie wielu genów segmentacyjnych, takich jak geny reguły pary. Geny gap są wyrażane w blokach wzdłuż przedniej-tylnej osi muchy wraz z innymi czynnikami transkrypcyjnymi wpływającymi na matkę, tworząc w ten sposób strefy, w których wyrażane są różne kombinacje czynników transkrypcyjnych. Geny rządzące parą są oddzielone od siebie przez komórki nieekspresyjne. Co więcej, pasy ekspresji dla różnych genów z regułami par są kompensowane przez kilka średnic komórek od siebie., Tak więc, unikalne kombinacje pary reguły genu ekspresji tworzyć przestrzenne domeny wzdłuż przednia-tylna oś ustawić każdy z 14 poszczególne segmenty. Dobrze scharakteryzowano wzmacniacz 480 bp odpowiedzialny za prowadzenie ostrego paska dwóch par genu parzystego (Ewy). Enhancer zawiera 12 różnych miejsc wiązania dla czynników transkrypcyjnych genów matczynych i gap. Miejsca aktywacji i tłumienia pokrywają się kolejno., Eve jest wyrażany tylko w wąskim pasku komórek, które zawierają wysokie stężenia aktywatorów i niskie stężenie represorów dla tej sekwencji wzmacniacza. Inne regiony wzmacniające powodują ekspresję eve w 6 innych paskach w zarodku.
w kręgownictwie
ustalenie osi ciała jest krytycznym krokiem w rozwoju zwierząt. Podczas rozwoju zarodkowego myszy, węzłowy, transformujący czynnik wzrostu-ligand nadrodziny beta, jest kluczowym genem biorącym udział w modelowaniu zarówno przedniej-tylnej osi, jak i lewej-prawej osi wczesnego zarodka., Gen węzłowy zawiera dwa wzmacniacze: Proximal Epiblast Enhancer (PEE) i Asymmetric Enhancer (ASE). PEE znajduje się przed genem węzłowym i napędza ekspresję węzłową w części smugi prymitywnej, która różnicuje się w węzeł (zwany także węzłem prymitywnym). PEE włącza ekspresję węzłową w odpowiedzi na połączenie sygnalizacji Wnt z drugim, nieznanym sygnałem; tak więc członek rodziny czynników transkrypcyjnych LEF / TCF prawdopodobnie wiąże się z miejscem wiązania TCF w komórkach w węźle., Dyfuzja węzła z dala od węzła tworzy gradient, który następnie kształtuje rozszerzającą się oś przednio-tylną zarodka. ASE jest intronicznym wzmacniaczem związanym z czynnikiem transkrypcji domeny fox1. We wczesnej fazie rozwoju ekspresja węzłowa napędzana przez Fox1 ustanawia endodermę trzewną. W późniejszym okresie rozwoju Wiązanie Fox1 z ASE napędza ekspresję węzłową po lewej stronie mezodermy płytki bocznej, ustanawiając w ten sposób asymetrię lewo-prawo niezbędną do asymetrycznego rozwoju narządów w mezodermie.,
utworzenie trzech warstw zarodkowych podczas gastrulacji jest kolejnym krytycznym krokiem w rozwoju zwierząt. Każda z trzech warstw zarodkowych ma unikalne wzorce ekspresji genów, które promują ich różnicowanie i rozwój. Endoderma jest określana we wczesnym stadium rozwoju przez ekspresję Gata4, a Gata4 prowadzi później do morfogenezy jelit. Ekspresja Gata4 jest kontrolowana we wczesnym zarodku przez introniczny wzmacniacz, który wiąże inny czynnik transkrypcyjny domeny widłaka, FoxA2., Początkowo enhancer napędza szeroką ekspresję genu w zarodku, ale ekspresja szybko ogranicza się do endodermy, co sugeruje, że inne represory mogą być zaangażowane w jego ograniczenie. Pod koniec rozwoju ten sam wzmacniacz ogranicza ekspresję do tkanek, które staną się żołądkiem i trzustką. Dodatkowy wzmacniacz jest odpowiedzialny za utrzymanie ekspresji Gata4 w endodermie podczas pośrednich etapów rozwoju jelit.,
wiele enhancerów promuje odporność rozwojowąedytuj
niektóre geny biorące udział w krytycznych procesach rozwojowych zawierają wiele enhancerów o nakładającej się funkcji. Wtórne enhancers, lub „Shadow enhancers”, można znaleźć wiele kilobaz daleko od pierwotnego enhancer („primary” zwykle odnosi się do pierwszego enhancer odkryte, który jest często bliżej genu reguluje). Na własną rękę, każdy wzmacniacz napędza prawie identyczne wzorce ekspresji genów. Czy te dwa wzmacniacze są naprawdę zbędne?, Ostatnie badania wykazały, że wiele wzmacniaczy pozwala muszom owocowym przetrwać perturbacje środowiskowe, takie jak wzrost temperatury. Gdy podniesiony w podwyższonej temperaturze, pojedynczy wzmacniacz czasami nie prowadzi kompletny wzór ekspresji, podczas gdy obecność obu wzmacniaczy pozwala na normalną ekspresję genów.