podstawowa technika wykrywania RFLPs polega na fragmentacji próbki DNA z zastosowaniem enzymu restrykcyjnego, który może selektywnie rozszczepić cząsteczkę DNA wszędzie tam, gdzie krótka, specyficzna sekwencja jest rozpoznawana w procesie znanym jako digest restrykcyjny. Fragmenty DNA wytwarzane przez proces fermentacji są następnie oddzielane długością w procesie znanym jako elektroforeza w żelu agarozowym i przenoszone do membrany za pomocą procedury Southern blot., Hybrydyzacja membrany do znakowanej sondy DNA określa następnie długość fragmentów, które są komplementarne do sondy. Polimorfizm długości fragmentu ograniczającego występuje, gdy długość wykrytego fragmentu różni się między osobnikami, co wskazuje na nie identyczną homologię sekwencji. Każda długość fragmentu jest uważana za allel, niezależnie od tego, czy faktycznie zawiera region kodujący, czy nie, i może być wykorzystana w późniejszej analizie genetycznej.,
Analiza i dziedziczenie allelicznych fragmentów RFLP (NIH)
schemat RFLP według zmienności długości vntr
przykładyedit
istnieją dwa wspólne mechanizmy, dzięki którym Rozmiar określonego fragmentu ograniczenia może się różnić. W pierwszym schemacie mały segment genomu jest wykrywany przez sondę DNA (grubsza linia)., W allelu A Genom jest rozszczepiany przez enzym restrykcyjny w trzech pobliskich miejscach (trójkątach), ale tylko najbardziej prawy fragment zostanie wykryty przez sondę. W allelu a, miejsce ograniczenia 2 zostało utracone przez mutację, więc sonda wykrywa teraz większy skondensowany fragment biegnący z miejsc 1 do 3. Drugi diagram pokazuje, jak ta zmiana rozmiaru fragmentu wyglądałaby na południowej plamie i jak każdy allel (po dwa na osobnika) może być dziedziczony u członków rodziny.,
w trzecim schemacie sonda i enzym restrykcyjny są wybierane do wykrywania regionu genomu, który zawiera zmienną liczbę tandem repeat (vntr) segment (pola na schemacie). W allelu c występuje pięć powtórzeń w VNTR, a sonda wykrywa dłuższy fragment między dwoma miejscami ograniczenia. W allelu d w VNTR są tylko dwa powtórzenia, więc sonda wykrywa krótszy fragment między tymi samymi dwoma miejscami ograniczenia. Inne procesy genetyczne, takie jak insercje, delecje, translokacje i inwersje, mogą również prowadzić do polimorfizmów., Testy RFLP wymagają znacznie większych próbek DNA niż krótkie testy tandemowe (STR).