czym jest RNA-seq?
RNA-seq (RNA-sequencing) jest techniką, która może badać ilość i sekwencje RNA w próbce przy użyciu sekwencjonowania nowej generacji (NGS). Analizuje transkryptom wzorców ekspresji genów zakodowanych w naszym RNA. W tym miejscu przyjrzymy się, dlaczego RNA-seq jest przydatny, jak działa ta technika i podstawowy protokół, który jest powszechnie używany dzisiaj. 1
jakie są zastosowania RNA-seq?,
RNA-seq pozwala nam zbadać i odkryć transkryptom, całkowitą zawartość komórkową RNA, w tym mRNA, rRNA i tRNA. Zrozumienie transkryptomu jest kluczowe, jeśli mamy połączyć informacje o naszym genomie z jego funkcjonalną ekspresją białek. RNA-seq może nam powiedzieć, które geny są włączone w komórce, jaki jest ich poziom ekspresji i w jakim czasie są aktywowane lub wyłączone2. Pozwala to naukowcom głębiej zrozumieć biologię komórki i ocenić zmiany, które mogą wskazywać na chorobę., Niektóre z najbardziej popularnych technik wykorzystujących RNA-seq to profilowanie transkrypcyjne, identyfikacja SNP, edycja RNA i analiza ekspresji genów różnicowych3.
może to dać badaczom istotne informacje na temat funkcji genów. Na przykład transkryptom może wyróżnić wszystkie tkanki, w których wyraża się gen o nieznanej funkcji, co może wskazywać na jego rolę. Rejestruje również informacje o alternatywnych zdarzeniach splicingu (Rysunek 1), które wytwarzają różne transkrypty z jednej sekwencji genu. Zdarzenia te nie zostaną wychwycone przez sekwencjonowanie DNA., Może również identyfikować modyfikacje potranskrypcyjne, które występują podczas przetwarzania mRNA, takie jak poliadenylacja i 5 ' capping2.
Rysunek 1: Wykorzystanie danych RNA-seq wykorzystuje krótkie odczyty mRNA, który jest wolny od wewnątrzkodującego niekodującego DNA. Odczyty te muszą być wyrównane z powrotem do genomu odniesienia.
jak działa RNA-seq?
wczesne techniki RNA-seq wykorzystywały technologię sekwencjonowania Sangera, technikę, która chociaż była innowacyjna w tym czasie, była również niska przepustowość, kosztowna i niedokładna., Dopiero niedawno, wraz z pojawieniem się i rozprzestrzenianiem się technologii NGS, byliśmy w stanie w pełni wykorzystać potencjał RNA-seq4.
pierwszy krok w technice polega na konwersji populacji RNA do sekwencjonowania na fragmenty cDNA (biblioteka cDNA). Pozwala to na umieszczenie RNA w przepływie pracy NGS. Adaptery są następnie dodawane do każdego końca fragmentów. Adaptery te zawierają elementy funkcjonalne, które umożliwiają sekwencjonowanie; na przykład element wzmacniający i główne miejsce sekwencjonowania., Biblioteka cDNA jest następnie analizowana przez NGS, tworząc krótkie sekwencje, które odpowiadają jednemu lub obu końcom fragmentu. Głębokość, do której Biblioteka jest sekwencjonowana, zależy od technik, do których będą wykorzystywane dane wyjściowe. Sekwencjonowanie często następuje albo jeden odczyt lub sparowany koniec metody sekwencjonowania. Sekwencjonowanie jednokrotnego odczytu jest tańszą i szybszą techniką (dla odniesienia, około 1% kosztów sekwencjonowania Sangera), która sekwencjonuje cDNA tylko z jednego końca, podczas gdy sekwencja metod paired-end z obu końców, a zatem jest droższa i czasochłonna5, 6.,
należy dokonać dalszego wyboru między protokołami specyficznymi dla poszczególnych nici i niepowiązanymi. Pierwsza metoda oznacza, że zachowana jest informacja o tym, która nić DNA została transkrybowana. Wartość dodatkowych informacji uzyskanych z protokołów specyficznych dla danego pasma czyni z nich korzystną opcję.
odczyty te, których będzie wiele milionów do końca obiegu pracy, można następnie dopasować do genomu odniesienia i zmontować, aby stworzyć mapę sekwencji RNA obejmującą transkryptome7.,
RNA-seq vs microarrays: Why RNA-seq is considered superior
RNA-seq is powszechnie considered as superior to other technologies, such as microarray hybridization. Istnieje kilka przyczyn uznanego statusu RNA-seq
protokół RNA-seqplanowanie planu
przygotowanie przed rozpoczęciem eksperymentu RNA-seq jest niezbędne. Pytania, na które należy odpowiedzieć przed rozpoczęciem:
•jakiej metody oczyszczania RNA używasz?
* ile czytań będziesz potrzebował?
•z której platformy skorzystasz?,
•jakiego genomu referencyjnego użyjesz?
* Jak oceniasz jakość swojego RNA?
•czy musisz wzbogacić swój docelowy RNA?
czy zdołasz kodować swoje RNA?
Czy mam wystarczająco dużo replik biologicznych i technicznych?
•sekwencjonowanie jednostkowe czy sparowane?
Przygotowanie biblioteki cDNA
po rozważeniu tych punktów możesz rozpocząć przygotowanie biblioteki cDNA. Będzie to wymagało dodania specyficznych dla platformy „sekwencji adapterów” i wzmocnienia DNA, ale dokładna procedura będzie bardzo specyficzna dla platformy używanej na tym etapie., Amplifikacja DNA obejmuje syntezę pierwszej nici za pośrednictwem odwrotnej transkryptazy, a następnie syntezę drugiej nici za pośrednictwem polimerazy DNA 10,11.
sekwencjonowanie cDNA
Po przygotowaniu biblioteki i dodaniu adapterów możesz użyć wybranej platformy sekwencjonowania, aby uporządkować bibliotekę cDNA do żądanej głębokości. Po wyprodukowaniu danych transkrypcji można mapować dane do genomu referencyjnego., Proces wyrównywania może być skomplikowany przez obecność wariantów splotu i modyfikacji, a wybór zastosowanego genomu referencyjnego będzie również różny, jak trudny jest ten etap. Na tym etapie przydatne są pakiety oprogramowania, takie jak STAR, podobnie jak narzędzia kontroli jakości, takie jak Picard lub Qualimap12.
analiza danych RNA-Seq
Po etapie wyrównania możesz skupić się na analizie danych. Narzędzia takie jak Sailfish, Rsem i BitSeq12 pomogą Ci określić poziom ekspresji, podczas gdy narzędzia takie jak MISO, które kwantyfikują alternatywnie spliced geny, są dostępne do bardziej specjalistycznej analizy13., Istnieje Biblioteka tych narzędzi, a czytanie recenzji i podsumowań to najlepszy sposób na znalezienie odpowiedniego narzędzia do badań.
podsumowując, współczesny RNA-seq jest dobrze ugruntowany jako wariant nadrzędny wobec mikroarrayów i prawdopodobnie pozostanie preferowanym wariantem na razie.
5.https://systemsbiology.columbia.edu/genome-sequencing-defining-your-experiment
6.https://emea.illumina.com/science/technology/next-generation-sequencing/paired-end-vs-single-read-sequencing.html
9.https://cofactorgenomics.com/advantages-rna-seq-over-microarray-technology/
10.http://bioinformatics.ucdavis.edu/docs/2015-june-workshop/_downloads/Th_MB_RNASeq_Intro.pdf
11.https://rnaseq.uoregon.edu/#library-prep-stranded-libraries