Zwierzęta
wszystkie eksperymenty przeprowadzono z użyciem nie hodujących samców i samic myszy C57/B6 (w wieku 2-3 miesięcy). Każda płeć przyczyniła się do około połowy całkowitej liczby zwierząt w każdym eksperymencie. Zwierzęta trzymano w cyklu ciemno/jasnym 12/12 h i miały nieograniczony dostęp do żywności i wody., Wykorzystanie myszy w tych eksperymentach było zgodne z Guide for the Care and Use of Laboratory Animals I Protokoły eksperymentalne zostały zatwierdzone przez University of Southern California Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
ekspozycja na światło
oczy zostały rozszerzone 0,5% roztworem okulistycznym Tropicamidu, USP (AKORN) i 2,5% roztworem chlorowodorku fenylefryny, USP (AKORN). Myszy były przystosowane do ciemności w nocy., Były trzymane w ciemności lub wystawione na działanie rozproszonego zimnego białego światła fluorescencyjnego na poziomie luminescencji 5000 luksów przez 30 minut do 1 godziny przed eutanazją. Ciemne próbki dla obu metod przygotowywano w ciemni w świetle podczerwonym, a wszystkie zabiegi z udziałem ciemnych tkanek wykonywano przy użyciu mikroskopu rozwarstwiającego wyposażonego w Konwertery podczerwieni (B. E. Meyers & Co, Inc.). Naświetlone na światło próbki były przetwarzane w ramach rozwarstwienia w świetle pokojowym.,
rozwarstwienie siatkówki
u myszy przeprowadzono eutanazję przez inhalację izofluranu, a następnie zwichnięcie szyjki macicy. Oczy zostały wyłuszczone, a siatkówki wyizolowano w szalce Petriego o wymiarach 35 × 10 mm wypełnionej odpowiednim buforem/roztworem opisanym poniżej. Z każdego oka usunięto rogówkę, soczewkę i ciało szkliste, a nabłonek pigmentowany siatkówki (RPE) i twardówkę starannie odrywano od każdej siatkówki. Wyizolowane siatkówki były hemisected piórem skalpelem w naczyniu 60 × 15 mm, a krawędzie zostały przycięte, aby utworzyć dwa prostokąty., Minimalizacja krzywizny każdej połówki siatkówki wspomagała spłaszczenie siatkówki i zapewniała dokładne złuszczenie warstw siatkówki. Właściwe przycinanie składanych krawędzi siatkówki jest niezbędne: jeśli siatkówka ma składane krawędzie po umieszczeniu na bibule filtracyjnej, spowoduje to zmniejszenie wydajności izolowanych ROS i co ważniejsze zostanie zanieczyszczona innymi warstwami siatkówki.
Immunocytochemia
przed wyłuszczeniem biegun górny rogówki oznaczano kauteryzacją, a następnie usuwano rogówkę, soczewkę i ciało szkliste., Pozostałe kubki oczne umieszczano w 4% paraformaldehydu w PBS przez 15 min i płukano 3 razy przez 10 min w PBS. Kubki oczne były krioprotekowane w 30% sacharozie w PBS przez 2 h, umieszczane w związku Tissue-Teck® O. C. T. (Sakura Finetek, USA) i szybko zamrażane w płynie N2. Zamrożone bloki sekowano w temperaturze 10 µm w kriostacie (CM 3050 S, Leica Microsystems) i przechowywano w temperaturze -80 °C. przed inkubacją przeciwciał sekcje były równoważone do temperatury pokojowej (RT) przez 15 minut., W przypadku barwienia GNAT1 przy użyciu mysich przeciwciał monoklonalnych TF-15, pobrano epitop: sekcje były poddawane 2-minutowej RT z 0,02 mg/ml proteinazy K w buforze blokującym (2% albuminy surowicy bydlęcej, 2% surowicy koziej, 0,3% Triton X-100 W 1X PBS) i ogrzewane do temperatury 65 °C przez 10 s, a następnie pięć płukań PBS. Następnie na wszystkie sekcje naniesiono bufor blokujący przez 1 h. sekcje inkubowano z przeciwciałem królika przeciwko ARR1 (c10c10 rozcieńczony 1:100 w buforze blokującym) lub TF-15 (CytoSignal, rozcieńczony 1:200 w buforze blokującym)., Sekcje płukano i inkubowano za pomocą wtórnego przeciwciała znakowanego fluoresceiną (laboratoria wektorowe). Wszystkie sekcje zostały następnie dwukrotnie zabarwione biotylowanym przeciwciałem przeciwko rodopsynie (1D4 rozcieńczony 1:300 w buforze blokującym). Sekcje płukano i inkubowano Awidyną rodaminową D (1:100, Vector Laboratories). Obrazy uzyskano za pomocą mikroskopu Aksjoplan2 firmy Zeiss. Jasne i ciemne warunki zostały zobrazowane przy użyciu identycznych czasów ekspozycji.,
kolekcja ROS przez sekwencyjne peeling z bibułą filtracyjną
metoda peelingu z bibułą filtracyjną została zaadaptowana z techniki eksponowania fluorescencyjnie oznakowanych komórek bipolarnych w płaskiej oprawie siatkówki do nagrań patch clamp . Odrywanie wielu warstw komórek fotoreceptora papierem filtracyjnym stopniowo eksponuje dendryty komórek bipolarnych i ciała komórkowe dla łatwiejszego dostępu do stymulacji elektrycznej i odczytów patch clamp. Odkryliśmy, że obrane produkty uboczne, warstwy fotoreceptorów przyklejone do bibułki filtracyjnej, były podatne na późniejsze analizy Western blot.,
medium Amesa zostało wykorzystane do manipulacji żywą tkanką siatkówki (Sigma-Aldrich A1420). Przygotowano dwa różne bufory: Ames'-HEPES (do 1 L dodać 2,38 G HEPES, 0,877 G NaCl, pH 7,4) i Ames'-wodorowęglan (do 1 L dodać 1,9 g NaHCO3, pH 7,4). Oba były wcześniej przygotowywane, sterylnie filtrowane i przechowywane w temperaturze 4 °C. wszystkie procedury były wykonywane w RTC., Przed rozwarstwieniem siatkówki 50-100 mL Ames'-HEPES zostało przepłukane 100% O2 w butelce GibcoTM 100 mL media (Thermo Fisher, USA), a 50-100 mL Ames'-wodorowęglanu zostało przepłukane 95% O2 i 5% CO2 w szczelnym pojemniku na 15-20 min przed użyciem.
siatkówki zostały przygotowane zgodnie z opisem w sekcji „rozwarstwienie siatkówki” i przechowywane w lekkim szczelnym pojemniku z amesem ” -wodorowęglanem bąbelkowanym 95% O2 i 5% CO2 w celu utrzymania fizjologicznego pH., Ten stan inkubacji jest identyczny z tym stosowanym przez fizjologów siatkówki do nagrań elektroretinogramów ex vivo lub nagrań elektrody ssącej i może utrzymać żywotność i funkcjonalność tkanek przez kilka godzin. Do każdego zabiegu peelingu zastosowano połówkowy kawałek prostokątnej przyciętej siatkówki. Tkankę przeniesiono za pomocą plastikowej pipety transferowej o pojemności 1,7 mL (cięcie końcówką) do szalki Petriego o wymiarach 35 × 10 mm zawierającej oksydowane Ames'-HEPES. Środek odświeżano co 10 minut podczas procesu peelingu, aby utrzymać stan natlenienia., Siatkówka w roztworze była zorientowana stroną fotoreceptora skierowaną w dół za pomocą pincety i pipety transferowej. Prostokątny kawałek papieru filtracyjnego o wymiarach 5 mm × 2,5 mm wycięty z papieru filtracyjnego VWR grade 413 (średnica 5,5 cm, rozmiar porów 5 µm, VWR, USA)został umieszczony w szalce Petriego obok siatkówki. Siatkówkę ostrożnie przesuwano pęsetą (lekko trzymając krawędzie) na bibułę filtracyjną z fotoreceptorem w dół. Gdy siatkówka została wyśrodkowana na bibule filtracyjnej, obie zostały ostrożnie wyciągnięte z Ames ' – HEPES., Dolna strona bibuły filtracyjnej (strona bez siatkówki) została wymazana na ręczniku papierowym, aby nasiąkać płynem na bibuły filtracyjnej (2-3 dabs). To stworzyło bezpieczną adhezję między komórkami fotoreceptora a włóknami bibuły filtracyjnej, a to przywiązanie było ważne dla usunięcia warstwy ROS. Kropla Amesa-HEPES z szalki Petriego została umieszczona na siatkówce, a papier filtracyjny ponownie rozmazał się na ręczniku papierowym. Powtórzono to łącznie trzy razy., Bibuła filtracyjna z siatkówką została następnie umieszczona z powrotem w szalce Petriego i zanurzona, a tkanka usunięta z bibuły filtracyjnej za pomocą pincety. Zadbano o to, aby dotknąć tylko skrajnego obwodu siatkówki, aby zachować integralność strukturalną siatkówki. Aby ułatwić proces obierania, brzegi siatkówki zostały delikatnie odrywane od bibuły filtracyjnej z każdej strony, rozluźniając przyczepność siatkówki do bibuły filtracyjnej., Po usunięciu siatkówki z bibuły filtracyjnej, dolna powierzchnia bibuły filtracyjnej została wymazana na ręczniku papierowym i umieszczona w tubie z napisem + ROS i była trzymana na lodzie. Opisany powyżej proces peelingu powtórzono około 7-8 razy. Po 5 peelingach siatkówka stała się cieńsza, bardziej przezroczysta i podatna na rozdarcia. Po obraniu rurkę +ROS zawierającą zebrane papiery filtracyjne i pozostałą obraną połową siatkówkę umieszczono w rurce-ROS, zamrożono na suchym lodzie i przechowywano w temperaturze -80 °C.,
oddzielanie komór fotoreceptorów przez peeling liofilizowanej siatkówki
metoda ta została zaadaptowana z opisanej przez M. E. Guido, et al. , który zaprojektował metodę obierania taśmy ScotchTM, która wykorzystywała liofilizowane siatkówki piskląt, aby selektywnie rozdzielić siatkówkę na różne warstwy (komórki fotoreceptora, wewnętrzną warstwę jądrową i komórki zwojowe)., Ponieważ siatkówki z różnych modeli zwierzęcych mają różne rozmieszczenie pręcików i stożków i mogą oddzielić się asymetrycznie taśmą po liofilizacji, zaadaptowaliśmy tę metodę i zbadaliśmy jej użyteczność do oddzielania przegród prętowych siatkówki myszy.
liofilizacja pojedynczych siatkówki
siatkówki zostały przygotowane zgodnie z opisem w sekcji „rozwarstwienie siatkówki”. Podczas rozwarstwienia użyto zimnych pierścieni (130 mM NaCl, 3,6 mm KCl, 2,4 mm MgCl2, 1,2 mm CaCl2, 10 mm HEPES, 0,02 mm EDTA, pH 7,4). Można również stosować inne bufory fizjologiczne, takie jak Ames ' – HEPES., Ponieważ wiele próbek było często przetwarzanych w tym samym czasie, kawałki papieru filtracyjnego 5 × 2,5 mm (jakościowy papier filtracyjny Whatman® Grade 1 (średnica 9 cm, rozmiar porów 11 µm, GE Healthcare, USA)) były oznaczane z wyprzedzeniem, zanim zostały umieszczone w szalce Petriego wypełnionej zimnym buforem Ringera. Dla każdej próbki na bibule filtracyjnej za pomocą pipetu transferowego o pojemności 1,7 mL (wycięta końcówka) umieszczono połówkowy, prostokątny fragment siatkówki, z bokiem komórki zwojowej w dół i bokiem segmentu zewnętrznego fotoreceptora w górę., Gdy tkanka została wyśrodkowana na bibule filtracyjnej, obie zostały podniesione z bufora dzwonka, a spód bibuły filtracyjnej (strona bez siatkówki na niej) został zamazany na ręczniku papierowym (2-3 dabs) w celu ułatwienia przymocowania warstwy komórek zwojowych na bibule filtracyjnej. Kropla zimnego dzwonka została umieszczona na siatkówce, a spód papieru filtracyjnego został ponownie zamazany na ręczniku papierowym. Powtórzono to łącznie trzy razy. Bufor Ringera został zamieniony na nowy bufor zimnego Ringera po każdym przygotowaniu próbki., Papier filtracyjny z dołączoną siatkówką umieszczano w szalce Petriego wypełnionej zimnym pierścieniem, dopóki wszystkie próbki nie zostały przetworzone w ten sam sposób. Ostatecznie każdy z nich został ponownie wyjęty z roztworu, dno bibuły filtracyjnej wymazane na sucho, a kropla zimnego PBS umieszczona na papierze filtracyjnym obok siatkówki, dno filtra ponownie wymazane i umieszczone w czystej i suchej szalce Petriego 35 × 10 mm. Celem tego etapu było spłukanie bardziej złożonych dzwonków z PBS w celu zmniejszenia ilości wysuszonej soli na liofilizowanej tkance., Po tym, jak wszystkie próbki tkanek zostały przetworzone w tym końcowym etapie płukania i zebrane do czystej szalki Petriego, naczynie zostało owinięte lekko szczelnie dwiema warstwami 2,5 × 2,5 cala kwadratowych kawałków folii aluminiowej, z małymi otworami, dzięki czemu ciemne próbki siatkówki nie są wystawione na działanie światła i szybko zamrożone w cieczy N2. Małe otwory umożliwiały płynny dostęp N2 do wnętrza, wypełniając szalkę Petriego i zadbano o to, aby otwory zostały przesunięte tak, aby szalka Petriego była owinięta lekko., Następnie szalkę Petriego umieszczano w kolbie Labconco o pojemności 600 mL przy użyciu liofilizatora VirTis Benchtop 2 K (SP Scientific, USA) przez 30 minut w celu liofilizacji tkanki.
obieranie warstw siatkówki za pomocą taśmy ScotchTM
liofilizowane tkanki siatkówki były przechowywane w temperaturze -80 °C w pojemniku wypełnionym suszarką (W. A. Hammond Drierite Co, USA) lub izolowane jako +ROS, +RIS i-ROS / RIS-zubożona tkanka (- OIS), ponownie zamrożone jak powyżej lub przetworzone na Zachodnie plamy tego samego dnia. Wszystkie zabiegi peelingu wykonywane były w świetle pokojowym. Paski mniejsze niż 2.,5 mm szerokości zostały wycięte i umieszczone na krawędzi dozownika taśmy, aż zostaną przycięte na prostokątne kawałki. Liofilizowana siatkówka przymocowana do bibuły filtracyjnej Whatman® została umieszczona w czystej 10 cm szalce Petriego. Mały prostokątny kawałek taśmy ScotchTM (nieco większy od powierzchni tkanki) został wycięty i starannie ułożony na wierzchu liofilizowanej siatkówki. Umieszczenie taśmy na wierzchu liofilizowanej siatkówki było prawie wystarczające, aby przymocować do taśmy pomarańczową warstwę ROS., Aby zapewnić całkowity kontakt ROS z taśmą, lekko naciskano pincetą na górną część taśmy, aby zapewnić kontakt z górną powierzchnią. Po dokładnym odrywaniu taśmy przylgnęła do niej pomarańczowa warstwa różu i oddzieliła się od reszty siatkówki. Frakcja ta została oznaczona jako + ROS i umieszczona w czystej probówce mikrofugowej. Często cienka, biała folia była widoczna na pękniętej powierzchni pomarańczowej warstwy na pierwszej skórce taśmy., Ta powierzchnia była usuwana przez więcej obierek taśmowych, dopóki nie została całkowicie usunięta, a pomarańczowy kolor warstwy ROS został przeniesiony na powierzchnię. Ta biała warstwa początkowo przymocowana do ROS została umieszczona w osobnej tubie i oznaczona jako frakcja + RIS. Taśma została użyta do usunięcia resztek tkanki siatkówki z bibułki filtracyjnej i została umieszczona w rurce oznaczonej-OIS., Ilość nacisku wywieranego na taśmę przy początkowej skórce pomarańczowej warstwy ROS miała wpływ na sposób frakcjonowania liofilizowanej próbki; zbyt duże ciśnienie powodowało, że cała liofilizowana siatkówka odklejała bibułę filtracyjną na taśmę, a zbyt małe ciśnienie nie oddzielało górnej pomarańczowej warstwy od siatkówki. Kilka przejść nad taśmą przy minimalnym nacisku za pomocą pincety było pomocne w odczuwaniu minimalnej i maksymalnej ilości nacisku, aby dodać do górnej części taśmy.,
przygotowanie próbki Do Western blot: obieranie bibułą filtracyjną
tuby +ROS zawierające bibułę poddawano szybkiemu wirowaniu w mikrokentryfie przez 2 s i usuwano nadmiar cieczy. Każda rurka była przetwarzana pojedynczo (jedna połówka siatkówki) lub dwie rurki (dwie połówki siatkówki) były łączone dla bardziej skoncentrowanego materiału. Izolat + ROS w pojedynczej probówce homogenizowano w 45-60 µL bufora zimnej ripy (50 mM Tris–HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1% dezoksycholanu sodu, 0,1% SDS, 1 mm EDTA, 0.,1 M PMSF, kompletny inhibitor mini proteazy (Roche Applied Sciences)), a izolat-ROS w pojedynczej probówce został homogenizowany w buforze RIPA 80-100 µL. Po połączeniu dwóch probówek do homogenizacji +ROS użyto 80-110 µL zimnego bufora RIPA, a do-ROS użyto 100-150 µL zimnego bufora. Wszystkie probówki były homogenizowane przez 1 min za pomocą autoklawizowanego tłuczka. Dołożono wszelkich starań, aby upewnić się, że kawałki papieru filtracyjnego w tubkach +ROS były trzymane z boku tubek i pozostawały w kontakcie z tłuczkiem, zamiast tkwić na dnie., Po homogenizacji sterylne pęsety były używane do przenoszenia kawałków papieru filtracyjnego na bok rury + ROS, a następnie 2-4 S wirowania w mikrocentryfuge. Ten spin wyodrębnił ciecz z papieru, a ciecz została przeniesiona do czystej rurki i przetworzona dla Western blot, jak opisano poniżej. Był to najbardziej czasochłonny krok, a jeśli nie zostanie wykonany prawidłowo, duża część próbki może zostać wchłonięta przez kawałki bibuły filtracyjnej. Aby zmaksymalizować odzyskiwanie próbki, rozmiar kawałków bibuły filtracyjnej używanych do peelingu należy przyciąć, aby pasował do obszaru tkanki siatkówki.,
przygotowanie próbki: peeling taśmą ScotchTM
podobnie jak w przypadku peelingu filtracyjnego połączono dwie probówki, z których każda zawiera obraną warstwę z połowy siatkówki, w celu zwiększenia stężenia białka. Próbki +ROS i + RIS zostały homogenizowane w 100-115 µL, a próbki-OIS w 125 µL zimnego buforu RIPA. Wszystkie probówki były homogenizowane przez 1 min. Dołożyliśmy wszelkich starań, aby taśma w lampach + ROS, + RIS i-OIS pozostawała w kontakcie z tłuczkiem i aby taśma była trzymana z boku lamp, a nie przyklejana do dołu., Po homogenizacji sterylne pęsety były używane do przenoszenia kawałków taśmy na bok rurek. Rurki obracano w mini wirówce przez 2-4 s, po czym ostrożnie usuwano wysuszone kawałki taśmy.
kwantyfikacja białek, elektroforeza żelowa i immunobloty białkowe
do określenia całkowitej ilości białka w każdej próbce użyto zestawu do oznaczania białka BCA (Thermo Scientific, USA). Do próbek dodano dwa mikrolitry DNaseI (10 jednostek / µL, Roche, Szwajcaria) i pozostawiono w temperaturze pokojowej przez 30 minut., Do homogenitu dodano odpowiednią objętość 4-krotnego bufora próbki SDS (40% glicerolu, 240 mM Tris Zasady pH 6,8, 8% SDS, 5% ßME, 0,04% błękit Bromofenolowy).,tr>
Approximately 10 μg of protein lysate was loaded per lane and separated on a pre-cast polyacrylamide Bis-Tris gel with a 4–12% gradient (Life Technologies, USA) and transferred onto nitrocellulose membrane., Membrany zostały zablokowane w 10% buforze mleka/TBS-T przez 1 h W RT i inkubowane przez noc z następującymi przeciwciałami:przeciwciało anty-ARR1 królika (1:1000, ref), przeciwciało monoklonalne myszy anty-GNAT1 (TF-15, 1:1000, CytoSignal), przeciwciało anty-β aktyny królika (1: 5000, GeneTex Inc.), przeciwciało królika anty-RGS9 (1: 1000), przeciwciało królika anty-Gß5L/s (CT215) (1:2000) oraz przeciwciało poliklonalne królika anty-cytochromu C (1:500, Santa Cruz, sc-7159). Membrany inkubowano fluorescencyjnie znakowanymi przeciwciałami wtórnymi (1:10 000, Biosciences LI-COR) w RT przez 1 h., Pasma białkowe zostały wykryte przez Odyssey ® infrared imaging system (LI-COR Biosciences, USA), a intensywność fluorescencji poszczególnych pasm została określona za pomocą ImageJ. Sygnały GNAT1, ARR1 i RGS9 zostały znormalizowane wobec Gß5L dla próbek +ROS, + RIS oraz wobec aktyny dla próbek-ROS i-OIS. Dla każdego niezależnego eksperymentu, sygnały fluorescencyjne dla każdego białka w każdym przedziale były również znormalizowane wobec połączonych sygnałów ze wszystkich przedziałów siatkówki. W celu określenia różnic między dwiema grupami zastosowano niesparowane 2-ogonowe t-testy.