surowica bydlęca płodowa (FBS) jest płynną frakcją skrzepniętej krwi z płodowych cieląt, zubożonej w komórki, fibryny i czynniki krzepnięcia, ale zawierającą dużą liczbę czynników odżywczych i makrocząsteczkowych niezbędnych do wzrostu komórek. Albumina surowicy bydlęcej jest głównym składnikiem FBS. Czynniki wzrostu w FBS są niezbędne dla utrzymania i wzrostu hodowanych komórek . FBS zawiera również wiele małych cząsteczek, takich jak aminokwasy, cukry, lipidy i hormony.
FBS jest stosowany w szerokim zakresie zastosowań., Jednym z podstawowych zastosowań FBS jest w eukariotycznej hodowli komórkowej, z koncentracjami do 20% lub nawet więcej, gdzie dostarcza wiele niezbędnych składników odżywczych i czynników wzrostu, które ułatwiają przetrwanie i proliferację komórek. Należy jednak pamiętać, że FBS w kulturach komórek ludzkich może wprowadzać artefakty badawcze; komórki ludzkie hodowane z surowic ludzkich zachowują się inaczej niż te hodowane z FBS ., FBS jest również stosowany w badaniach, produkcji i kontroli szczepionek dla ludzi i weterynaryjnych oraz leków biotechnologicznych, i stosowany w celu zatrzymania trawienia trypsyny lub jako środek ochronny w krioprezerwacji . Pożywki do hodowli komórek bez surowicy były używane od wielu lat. Surowica bydlęca płodowa może nie być najlepszym suplementem do hodowli komórkowej. Na przykład albumina surowicy bydlęcej z seleninem insulinotransferowo-sodowym i / lub czynnikiem wzrostu naskórka w pożywce hodowlanej poprawia jakość zarodka bydlęcego i inwazję trofoblastów w porównaniu z surowicą bydlęcą płodu .
serum płodowe zawiera więcej czynników wzrostu i ma niższą zawartość gamma globulin (tj. przeciwciał) oraz surowicę nie-płodową. Są one znacząco ponieważ wzrost czynniki ułatwiają komórki przetrwanie i proliferację podczas niweczniki mogą wiązać komórki w kulturze. Ponadto serum płodowe zawiera niższy poziom białek dopełniacza (uzupełnień) niż u dorosłych lub noworodków. Te suplementy mają niepożądane skutki lizowania komórek w hodowli i zakłócania testów immunologicznych.
zarówno surowica, jak i osocze pochodzą z krwi pełnej za pomocą wirowania w celu usunięcia składników, w tym krwinek czerwonych. Różnica między osoczem a serum polega na tym, że białka krzepnięcia są obecne w osoczu, ale zostały usunięte z surowicy. Osocze jest zazwyczaj przygotowywane przez dodanie antykoagulantów do krwi przed odwirowaniem, ale białka krzepnięcia nie są usuwane. Surowica jest przygotowywana przez umożliwienie krzepnięcia krwi przed odwirowaniem lub przez ekstensywne / progresywne odwirowanie. W związku z tym fibrynogen i białka związane z krzepnięciem nie są obecne w surowicy.,
u ludzi następujące 22 białka stanowią 99% całkowitej zawartości białka w surowicy i osoczu: albumina, całkowita IgG, transferryna, fibrynogen, całkowita IgA, alfa-2-makroglobulina, całkowita IgM, alfa-1-antytrypsyna, dopełniacz C3, haptoglobulina, alfa-1-kwaśna glikoproteina, apolipoproteina-B, apolipoproteina-A1, lipoproteina (a), czynnik H, Ceruloplazmina, dopełniacz C4, dopełniacz B, Pre-albumina, dopełniacz C9, dopełniacz C1Q i dopełniacz C8 . Pozostałe 1% zawiera setki białek., Najobficiej występujące białko w surowicy, albumina, w dawce 50 mg / ml, stanowi około połowę całkowitej masy białka .
Międzynarodowe Stowarzyszenie Przemysłu Serum (ISIA; www.serumindustry.org), organizacja handlowa dostawców serum, ustanowiła wytyczne dotyczące standaryzacji kontroli jakości. Wytyczne te wymagają przeprowadzenia następujących badań przy użyciu określonych metod, a wyniki badań muszą być dostępne jako certyfikat analizy (Tabela 1).,h>Test
bakterie i grzyby – test sterylności
mycoplasma
cytopathic agents – test wirusowy
hemadsorbing agents – test wirusowy
bovine virus diarrhea – test wirusowy
pomiar pH
osmolalność
białko całkowite, określone przez metoda biuret
endotoksyna
hemoglobina
wzór elektroforetyczny
badanie wydajności, takie jak hodowla komórek macierzystych
immunodiffuzja promieniowa
immunoglobulina
transfuzja gamma-glutamylowa (GGT)
tabela 1., Minimalne wymagania dotyczące badania surowicy.
endotoksyny, zwane również lipopolisacharydem (LPS) lub lipooligosacharydem (LOS), pochodzą z zewnętrznych błon bakterii Gram-ujemnych i przyczyniają się do klinicznych objawów różnych patogennych bakterii Gram-ujemnych. In vivo endotoksyny wywołują gorączkę i odpowiedź zapalną, podczas gdy w hodowli komórkowej wprowadzają zmiany w odpowiedzi komórkowej.
poziom endotoksyn mierzy się za pomocą testu lizynianu limulusa amebocytów (Lal)., Amebocyty są analogiczne do białych krwinek u kręgowców, a LAL jest wytwarzany z krwi Limulus polyphemus (Krab Podkowy amerykańskiej; ryc. 1). LAL jest bardzo wrażliwy na endotoksyny i koaguluje w obecności nawet minutowej ilości endotoksyny. Stan ochrony kraba Podkowy amerykańskiej został oceniony i omówiony w kulturze popularnej . Wiele populacji krabów podkowiastych jest zagrożonych i dlatego należy zadbać o ich ochronę przed utratą.
poniżej omówimy niektóre z powszechnie stosowanych surowic specjalistycznych. Preparaty Serum dedykowane do konkretnych tematów badawczych, takich jak serum niedoboru lipoprotein z Kalen Biomedical do badań nad cholesterolem, lub do specjalistycznych systemów ekspresji genów, takich jak tetracykliny przesiewane surowica płodowa bydlęca , nie są omawiane.
inne komponenty FBS mogą być wyczerpane, w zależności od wymagań eksperymentalnych. Na przykład Galmozzi A Et al zubożony hem z FBS z kwasem askorbinowym .
częstym zabiegiem FBS jest inaktywacja cieplna, gdzie FBS jest podgrzewany w temperaturze 56°C przez 30 minut w łaźni wodnej z sporadycznymi wstrząsami. Celem jest inaktywacja wszelkich składników układu dopełniacza obecnych w FBS i innych potencjalnych nieznanych inhibitorów wzrostu komórek., Wcześniej inaktywacja cieplna miała również na celu usunięcie zanieczyszczenia mycoplasma, co nie jest już problemem, ponieważ wszystkie produkty serum są teraz filtrowane przez rozmiary porów na tyle małe, aby usunąć mycoplasma. Należy zauważyć, że inaktywacja cieplna może mieć również niepożądane skutki, takie jak zmniejszenie zdolności hodowanych komórek do przyczepiania się do powierzchni .
kilku dostawców zaapelowało do użytkowników, aby nie inaktywowali termicznie FBS dla większości potrzeb hodowli komórkowej., W każdym przypadku zaleca się ocenę potrzeby inaktywacji cieplnej w danym zastosowaniu, ponieważ różne komórki mają różne reakcje na inaktywację cieplną FBS .
ponadto, podobnie jak wszystkie inne protokoły w odniesieniu do FBS, proces inaktywacji ciepła musi być przeprowadzony z ostrożnością, ponieważ zbyt wysoka temperatura lub długotrwałe ogrzewanie dezaktywuje czynniki wzrostu i generuje wytrącenia.
A431, HCC1569, MCF7, MDA-MB-231, MDA-MB-468, SCC25, SKBR3, T47D, RENCA i CT26.Linie komórkowe WT w mediach z 10% (v/v) inaktywowanym Cieplnie FBS ., Freeman SA i wsp. wykorzystywali inaktywowane termicznie FBS w swoich badaniach nad makrofagami . Aikawa T et al hodowane komórki glejowe myszy na kolbach powlekanych Poli-d-lizyną w DMEM zawierające 10% inaktywowanych Cieplnie FBS z MilliporeSigma (F2442). Feldman D et al hodował komórki HEK293FT w DMEM uzupełnione inaktywowaną termicznie surowicą bydlęcą z Seradigm (97068-085) oraz komórki a549, HCT116, HT1080, a375 z inaktywowaną termicznie surowicą bydlęcą z Sigma (F4135) w celu oceny optycznych ekranów zbiorczych ., Kulkarni S i wsp utrzymywali Hut – 78 komórek z inaktywowaną termicznie surowicą bydlęcą Z Atlanta Biologicals .
węgiel aktywny może wiązać się z cząsteczkami lipofilowymi, a zatem został użyty do usuwania hormonów, takich jak androgen, estradiol, progesteron, kortyzol, testosteron, trijodotyronina (T3) i tyroksyna (T4) z FBS. Te hormony lipidowe w surowicy mają tendencję do zakłócania układów immunologicznych i metod oznaczania insuliny. L Zhao i wsp. mierzyli wzrost komórek nowotworowych w pożywce hodowlanej uzupełnionej 10% surowicą pozbawioną węgla drzewnego .,
Dializa może usunąć wszystkie cząsteczki o masie cząsteczkowej mniejszej niż 10 000 MW z FBS. Dotyczy to zarówno polarnych, jak i Niepolarnych cząsteczek. Hormony, cytokiny, glukoza, aminokwasy i wiele innych są usuwane. Dializa usuwa również antybiotyki i inne cząsteczki egzogenne w FBS.
Dialized FBS firmy Thermo Fisher Scientific został użyty w hodowli gruczolakoraka trzustki do badań SILAC mass spec i innych badań SILAC , a także w hodowli komórek HeLa z analogiem met l-AHA pulse-chase do wykrywania kliknięć chemicznych długowiecznych białek .,
promieniowanie Gamma może być częścią procesu sterylizacji FBS. FBS jest zwykle filtrowany przez filtry 0,1 um wiele razy w celu wyeliminowania mikroorganizmów. Promieniowanie Gamma może inaktywować wirusy powszechnie występujące u bydła. Jednak niektóre gatunki wirusowe, takie jak parwowirus, są odporne na promieniowanie gamma.
chociaż FBS ma dość niską zawartość IgG, nawet ten poziom może być zbyt wysoki dla niektórych aplikacji. Poziom IgG może być znacznie obniżony przez chromatografię wychwytową., FBS z niskim IgG jest stosowany do produkcji przeciwciał, rekombinacji syntezy białek i innych zastosowań.
hodowla komórek macierzystych ma rygorystyczne wymagania w zakresie czynników wzrostu. Niektóre czynniki wzrostu obecne w FBS promują różnicowanie komórek macierzystych. Kilka firm oferuje embrionalnych komórek macierzystych kwalifikowanych FBS przeznaczonych do utrzymania niezróżnicowanych komórek macierzystych. Jednak ważne jest, aby przetestować konkretne partie FBS dla ich stosowalności w utrzymaniu pluripotency / totipotency różnych typów komórek macierzystych., Thermo Fisher zapewnia embrionalne komórki macierzyste kwalifikowane FBS, jak, na przykład, używane w hodowli komórek e14tg2a myszy ES przez Yasuda s et al.
główne kraje pochodzenia bydła są głównymi dostawcami FBS. Kraje obejmują USA, Australia, Nowa Zelandia, Kanada, kilka w Ameryce Południowej i Środkowej.
produkcja i zbieranie surowicăłw regulowane sÄ … przez agencje rzÄ … dowe. FBS jest oznaczony jako klasa USDA lub klasa Europejska., FBS klasy USDA można importować do dowolnego kraju wolnego od gąbczastej encefalopatii bydła i pryszczycy, podczas gdy FBS klasy europejskiej można sprzedawać w większości krajów Europejskich i azjatyckich.
FBS najlepiej przechowywać w temperaturze od -5 do -20°C i rozmrażać w temperaturze od 2 do 8°C. często przydatne jest dzielenie i zamrażanie serum w mniejszych porcjach, często 50 ml probówek, aby uniknąć wielu cykli zamrażania i rozmrażania. Czasami niektóre podliczniki FBS pozostają w cieczy w niskich temperaturach., Wynika to z braku ośrodka nukleacyjnego (cząstek stałych) do rozpoczęcia krystalizacji (zamrażania). Jeśli po prostu przesuniesz rurki palcem, Zwykle zestalają się prawie natychmiast.
po rozmrożeniu często dochodzi do wytrącania się osadu. Osad, prawdopodobnie w wyniku denaturacji niektórych białek surowicy, może zostać oczyszczony przez krótkie odwirowanie, co na ogół nie wpływa na jakość surowicy.
wielu dostawców zapewnia FBS o różnych klasach, kraju pochodzenia i leczeniu., FBS, sam w sobie, jest złożoną mieszaniną i należy się spodziewać zmienności między różnymi gatunkami, dostawcami i partiami. W związku z tym konieczne jest ustanowienie procesu wyboru i oceny FBS. Dobrym pomysłem jest zbadanie literatury w celu określenia, w jaki sposób konkretny wybór FBS był wcześniej używany w podobnych badaniach lub dla tej samej hodowli komórkowej i zwrócenie szczególnej uwagi na potencjalną zmienność lot-to-lot w FBS. Aby pomóc w tym, firma Labome przeprowadziła badanie wykorzystania FBS na podstawie publikacji naukowych, omówionych poniżej, aby pomóc naszym gościom wybrać najbardziej odpowiedni FBS.,
Labome bada literaturę zastosowanych materiałów. Tutaj podsumowano publikacje, w których cytowano surowicę bydlęcą płodu. Publikacje są przypadkowym podzbiorem ponad 10 000 publikacji.
głównymi dostawcami FBS są Life Technologies (obecnie część Thermo Fisher Scientific), Thermo Fisher Scientific Hyclone (obecnie część GE LifeScience) i MilliporeSigma (Tabela 2).
Life Technologies jest globalną firmą biotechnologiczną z siedzibą w Carlsbad w Kalifornii., Powstała w 2008 roku z połączenia Invitrogen Corporation i Applied Biosystems Inc. Wiele z ich produktów jest pod marką Gibco. Dostarczają produkty hodowli komórkowej, takie jak pożywka do hodowli komórek, FBS i inne odpowiednie odczynniki. Firma połączyła się z Thermo Fisher Scientific w 2014 roku.
FBS z Life Technologies został użyty do badania nukleolitu jako oddzielonego fazowo jednostki kontroli jakości białka w komórkach HEK293T i hela ., Pandolfini L et al hodowały komórki HEK293T i A549 w DMEM uzupełnione 10% Gibco FBS (10270-106) i Caco-2 w minimalnym niezbędnym pożywce Eagle uzupełnionym 20% Gibco FBS (10270-106) . Komórki HEK293T są dość często utrzymywane w 10% płodowej surowicy bydlęcej z Thermo Fishera .
GE Healthcare Hyclone FBS jest szeroko stosowany. De Cecco m i wsp używali go w 15% do utrzymania starzejących się fibroblastów LF1, IMR-90 i WI-38 w mediach Ham F-10 ., Nicetto D i wsp używali Hyclone FBS (SH30071) do zakończenia trawienia trypsyny i utrzymania komórek zarodkowych . Laflamme C i wsp. utrzymywali komórki HEK-293 w DMEM o wysokiej zawartości glukozy z GE Healthcare (SH30081.01) zawierające 10% surowicy cieląt bydlęcych z GE Healthcare (SH30072.03) .
Frohner IE et al utrzymał komórki Neuro-2A (N2a) i Cos-7 z kolekcji amerykańskiej kultury typowej w DMEM zawierające 10% FBS z Bovogen, Francja . Laflamme C et al hodowane komórki U2OS w DMEM o wysokiej zawartości glukozy zawierające 10% surowicy bydlęcej bez tetracyklin od Wisent (081150). Dong JX et al utrzymywali pierwotne Kultury hipokampa na Matrigel z Corning z 5% surowicą bydlęcą płodu z Atlanta Biologicals (S11550) ., Lee A Et al hodowane mysie C2C12 myoblasty z DMEM uzupełnione 10% surowicą bydlęcą płodu firmy VWR (89510-186) . Zhao N et al hodowane komórki U2OS z ATCC (HTB-96) w pożywce DMEM z 10% (v/v) surowicą bydlęcą płodu z Alat biologicznych . Liu x et al hodował komórki mysie 4T1 w DMEMsupplemented z 10% surowicą bydlęcą płodu z Biochromu .