wpływ czynników mutagennych na sekwencję DNA w roślinach
Tło:
współcześni hodowcy i rolnicy roślin mogą wykorzystywać bogactwo naturalnej różnorodności biologicznej, która może być szeroko rozszerzona poprzez zastosowanie technik indukcji mutacji., Wpływ mutacji indukowanej na poprawę plonów znajduje odzwierciedlenie w 2316 oficjalnie zarejestrowanych odmian (baza danych MAEA o oficjalnie zarejestrowanych odmianach zmutowanych, MVD) zawierających nową zmienność indukowaną. Ponadto około trzy czwarte z nich to bezpośrednie mutacje pochodzące z leczenia promieniami gamma, co podkreśla znaczenie mutagenów fizycznych. Wszystko to przekłada się na ogromny wpływ gospodarczy na Rolnictwo i produkcję żywności, która jest obecnie ceniona w miliardach dolarówi milionach uprawianych hektarów (Ahloowalia et al. w przygotowaniu.)., Jakkolwiek, chociaż agronomiczny potencjał indukowanej mutacji jest dobrze poznany, dokładny wpływ różnych czynników mutagennych na sekwencję DNA u roślin nigdy nie został opisany. Ponadto w ostatnich latach nowe technologie odwrotnej genetyki i odkrywania genów pobudziły zainteresowanie mutacją indukowaną. W przypadku tych nowych zastosowań konieczne jest wyraźniejsze zrozumienie rodzajów mutacji generowanych przez różne klasy mutagenów oraz zmierzenie ich częstotliwości i rozkładu wzdłuż genomu., Dziś, i po raz pierwszy, technologie są na miejscu do podjęcia eksperymentów niezbędnych do uzyskania tego zrozumienia.
czynniki mutagenne można podzielić na trzy kategorie: fizyczne( np. promienie gamma), chemiczne (np. sulfonian metanu etylu) i elementy transpozycyjne (takie jak transpozony,retrotranspozony, T-DNA, retrowirusy). Obecnie dostępne są ograniczone dane dotyczące zakresu efektów genetycznych wywołanych na poziomie molekularnym u roślin oraz specyficzności i skuteczności działania tych różnych kategorii czynników., Efekty te obejmują uszkodzenie DNA, co powoduje zmiany pary zasad (pojedyncze/proste polimorfizmy nukleotydów, SNP),małe wstawki i delecje (indele) oraz zmiany chromosomowe. Jeszcze mniej wiadomo o tym, jak indukowana mutacja oddziałuje z procesami epigenetycznymi, takimi jak metylacja, aktywacja retroelementów i perturbacja struktury DNA wyższego rzędu.,
podczas gdy hodowcy stosowali indukcję mutacji w celu poszerzenia Bazy Genetycznej plazmy zarodkowej i wykorzystywali linie mutacji bezpośrednio jako nowe odmiany lub jako źródła nowych odmian w programach krzyżowych, wiedza o dokładnym charakterze wywołanych mutacji nie była konieczna. Intuicyjnie za ideał uważano konserwatywny poziom małej pary bazowej i delecji. Obecnie wykorzystanie technik mutacji rozszerzyło się poza zastosowania w hodowli do odkrywania genów i genetyki odwrotnej., Te nowe aplikacje o wysokiej przepustowości wymagają określonych klas mutacji, które są indukowane z wysoką wydajnością w całych genomach roślin uprawnych, a w konsekwencji wiedza o dokładnym charakterze indukowanej mutacji staje się problemem.
metody wykrywania genów o dużej przepustowości zależą w dużej mierze od insertional 'knockout' lines, obecnie klasycznych 'maszyn genowych' i delecji 'knockout' bibliotek. Mutageneza insertywna wywołuje zwiększoną aktywność transpozycji znanych elementów transpozycyjnych (np., retrotranspozony, które mają tendencję do transponowania do aktywnych genów) wytwarzają szereg linesin, w których teoretycznie każdy gen w genomie zostanie inaktywowany przez wstawienie transpozonu. Linie te mogą być używane do identyfikacji genów, które powodują określone fenotypy lub, odwrotnie, mogą być używane do identyfikacji funkcji genu przez poszukiwanie fenotypu związanego z inaktywacją określonego znanego genu. Mutanty insertywne muszą jednak być niestabilne (np. wycięcie znacznika transpozonu, np., Układ binarny Ac / Ds w następnej generacji może spowodować powrót fenotypu do pierwotnego typu nadrzędnego, lub aktywacja znaczników retrotranspozonowych poprzez różne naprężenia może zwielokrotnić zdarzenia wstawiania, np. podczas mikropropagacji). W porównaniu z mutagenezą insercyjną konwencjonalna indukcja mutacji (tj. przy użyciu środków fizycznych lub chemicznych) zapewnia przewagę stabilnych mutacji.
teoretycznie tworzenie bibliotek delecji polega na wywoływaniu średnio dużych delecji, najlepiej o rozmiarze od 1 kb do 100 kb w każdej z serii linii.,Delecje te powinny obejmować segmenty każdego genu w repertuarze genetycznym i powinny być reprezentowane co najmniej przez jedną linię w bibliotece delecji. Te linie delecji mogą, gdy są stosowane razem z całym genomem, być wykorzystywane do identyfikacji genów odpowiedzialnych za określone fenotypy lub do potwierdzenia związku znanych genów z określonymi fenotypami.
nowatorskim i ważnym podejściem genetyki odwrotnej jest „targeting induced local lesions in genomes” (TILLING)., W tym przypadku, duża liczba małych zmian, albo podstawienie pary zasad DNA lub małe delecje obejmujące nie więcej niż kilka par zasad, są indukowane w szeregu linii. W tych liniach funkcja genu może być ustalona przez skojarzenie fenotypu ze zmianami w danym Genie i mogą być generowane nowe allele znanych genów.
w nadchodzących latach nowe technologie takie jak te będą miały coraz większy wpływ na praktyczną hodowlę roślin. Jednak będą wymagały różnych rodzajów mutacji indukowanych w określonych częstotliwościach., Aby dostosować proces mutacji, trzeba będzie zrozumieć, w jaki sposób poszczególne klasy mutacji są generowane i dystrybuowane na genomach. W przeszłości nie było to możliwe z powodu braku narzędzi analitycznych i niewystarczającej wiedzy zarówno na temat procesu uszkodzenia DNA, jak i architektury genomów roślinnych. Ponadto zsekwencjonowano tylko ograniczoną liczbę genów roślinnych. Obecnie wysokoprzepustowe metody sekwencjonowania DNA w połączeniu z bioinformatyką i funkcjonalnymi podejściami genomicznymi zapewniają rozległą wiedzę o architekturze genomu., Kompletna genomiczna sekwencja DNA modelowej dwuliściennej rośliny, Arabidopsis, i modelowego jednoliściennego ryżu, stała się dostępna w ostatnim czasie. Również naukowcy znaleźć się teraz z szereg metod, głównie opracowane jako markerów molekularnych technologii, które mogą być dostosowane do ilościowego określenia zmian w sekwencji DNA. Podsumowując, celem jest przeniesienie nauki o uszkodzeniach DNA wywołanych fizycznymi i chemicznymi mutagenami z ludzkiej genetyki do systemów roślinnych., Szereg technologii może być teraz używany do kwantyfikacji podstawowej stopy bazowej, przez liczbę pokoleń, spontanicznych mutacji i natychmiastowych skutków czynników mutacji. W ten sposób naukowcy teraz wreszcie znaleźć się w celu podjęcia eksperymentów, które mogą rozwikłać rodzaje mutacji indukowanych przez różne mutageny tak, że przyszli użytkownicy indukowanej mutacji mogą korzystać z technologii w pełni poinformowany sposób.,
cele:
celem jest zrozumienie mechanizmu indukcji mutacji w roślinach oraz określenie ilościowego rodzaju (zmiany bazowe lub delecje), częstości (szybkości zmian w stosunku do dawki mutagenów) i wzorców (indukcja zmian w różnych częściach genomu) zmian w Dnainducted przez szereg mutagenów fizycznych i chemicznych w szeregu kluczowych gatunków roślin uprawnych. Marker molekularny, macierz DNA i nowatorskie odwrotne metody genetyczne zostaną wykorzystane w unikalnym podejściu do analizy i badania indukcji mutacji wywołanych w wielu roślinach o znaczeniu agronomicznym., Wyniki te zostaną wykorzystane do dostarczenia protokołów i wytycznych ważnych dla przyszłego wykorzystania indukowanych mutacji w biologii roślin i poprawy plonów. Uzyskana wiedza pomoże państwom członkowskim we wzmocnieniu programów hodowli roślin poprzez zastosowanie ukierunkowanych mutacji indukowanych i komplementarnych podejść genomicznych w celu zwiększenia zrównoważoności rolnictwa, Bezpieczeństwa Żywności i stabilności gospodarczej. CRP wykorzysta nowe osiągnięcia w analizie DNA i genomice w celu określenia typów, częstotliwości, częstości i wzorców mutacji indukowanych przez różne mutageny., Stworzy to Bazę Wiedzy, która poprowadzi i pomoże przyszłym użytkownikom technologii indukowanych mutacji w celu poprawy upraw i genomiki.Ponadto koncentruje się na fizycznych mutagenach, takich jak gamma i szybkie neutrony lub promieniowanie rentgenowskie. Wybrane mutageny chemiczne zostaną również wykorzystane do porównania relatywnej skuteczności obu typów czynników mutagennych. Wpływ tych mutagenów zostanie oceniony na genetycznie jednorodny materiał siewny i rozmnażany wegetatywnie materiał roślinny.,Szczegółowe główne cele obejmują:
- określanie mechanizmów i całkowitego poziomu uszkodzeń DNA przy generacji M1, np. bezpośrednio w przetwarzanych nasionach w testach przed i po kiełkowaniu.
- określanie typów, częstotliwości, częstości i wzorców mutacji w pokoleniach M2, nad (a) całymi genomami i (b) W ukierunkowanych sekwencjach DNA w obrębie genomów.
- określanie rodzaju i częstości spontanicznych mutacji na przestrzeni pokoleń w kluczowych grupach roślin uprawnych (np. system select plant, w celu określenia spontanicznego tempa jako punktu odniesienia i jako nieodłącznego wskaźnika mutagenności genotypu).,
- przygotowanie protokołów i wytycznych dotyczących stosowania poszczególnych mutagenów do szeregu specyficznych zastosowań w ulepszaniu upraw i genomice.
- określenie podstaw chemicznych i molekularnych różnicowej wrażliwości na promieniowanie w różnych odmianach tego samego gatunku roślin uprawnych.
- oznaczanie typu i tempa początkowych mutacji spontanicznych, przy użyciu eksperymentów akumulacji mutacji wielopokoleniowych.
uczestnicy:
Pobierz pdf]
Kierownik Projektu:
P. J. L. Lagoda