Die grundlegende Technik zum Nachweis von RFLPs besteht darin, eine DNA-Probe unter Anwendung eines Restriktionsenzyms zu fragmentieren, das ein DNA-Molekül selektiv spalten kann, wo immer eine kurze, spezifische Sequenz in einem als Restriktionsverdauung bekannten Prozess erkannt wird. Die durch den Digest erzeugten DNA-Fragmente werden dann durch einen als Agarosegelelektrophorese bekannten Prozess nach Länge getrennt und über das Southern Blot-Verfahren auf eine Membran übertragen., Die Hybridisierung der Membran zu einer markierten DNA-Sonde bestimmt dann die Länge der Fragmente, die komplementär zur Sonde sind. Ein Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus soll auftreten, wenn die Länge eines detektierten Fragments zwischen Individuen variiert, was auf nicht identische Sequenzhomologien hinweist. Jede Fragmentlänge wird als Allel betrachtet, unabhängig davon, ob sie tatsächlich eine kodierende Region enthält oder nicht, und kann in der nachfolgenden genetischen Analyse verwendet werden.,
Schaltplan für RFLP durch Spaltstellenverlust
Analyse und Vererbung allelischer RFLP-Fragmente (NIH)
Schaltplan für RFLP by VNTR length variation
ExamplesEdit
Es gibt zwei gängige Mechanismen, mit denen die Größe eines bestimmten Restriktionsfragments variieren kann. Im ersten Schema wird ein kleines Segment des Genoms durch eine DNA-Sonde (dickere Linie) nachgewiesen., Im Allel A wird das Genom durch ein Restriktionsenzym an drei nahe gelegenen Stellen (Dreiecken) gespalten, aber nur das ganz rechte Fragment wird von der Sonde detektiert. Im Allel a ist die Stelle 2 durch eine Mutation verloren gegangen, so dass die Sonde nun das größere verschmolzene Fragment erkennt, das von den Stellen 1 bis 3 läuft. Das zweite Diagramm zeigt, wie diese Fragmentgrößenvariation auf einem Southern Blot aussehen würde und wie jedes Allel (zwei pro Individuum) in Mitgliedern einer Familie vererbt werden könnte.,
Im dritten Schema werden die Sonde und das Restriktionsenzym ausgewählt, um einen Bereich des Genoms zu detektieren, der ein Tandemwiederholungssegment (Variable Number Tandem Repeat, VNTR) mit variabler Anzahl enthält (siehe schematisches Diagramm). Im Allel c gibt es fünf Wiederholungen im VNTR, und die Sonde erkennt ein längeres Fragment zwischen den beiden Restriktionsstellen. Im Allel d gibt es nur zwei Wiederholungen im VNTR, so dass die Sonde ein kürzeres Fragment zwischen denselben beiden Restriktionsstellen erkennt. Andere genetische Prozesse wie Insertionen, Deletionen, Translokationen und Inversionen können ebenfalls zu Polymorphismen führen., RFLP-Tests erfordern viel größere DNA-Proben als kurze Tandem Repeat (STR) Tests.