Was ist RNA-seq?
RNA-seq (RNA-sequencing) ist eine Technik, die die Menge und Sequenzen von RNA in einer Probe unter Verwendung von Next Generation Sequencing (NGS) untersuchen kann. Es analysiert das Transkriptom von Genexpressionsmustern, die in unserer RNA kodiert sind. Hier sehen wir uns an, warum RNA-seq nützlich ist, wie die Technik funktioniert und das grundlegende Protokoll, das heute häufig verwendet wird1.
Was sind die Anwendungen von RNA-seq?,
Mit RNA-seq können wir das Transkriptom, den gesamten zellulären Gehalt von RNAs einschließlich mRNA, rRNA und tRNA, untersuchen und entdecken. Das Verständnis des Transkriptoms ist der Schlüssel, wenn wir die Informationen über unser Genom mit seiner funktionellen Proteinexpression verbinden wollen. RNA-seq kann uns sagen, welche Gene in einer Zelle aktiviert sind, wie hoch ihre Expression ist und zu welchen Zeiten sie aktiviert oder abgeschaltet2. Dies ermöglicht es Wissenschaftlern, die Biologie einer Zelle tiefer zu verstehen und Veränderungen zu beurteilen, die auf eine Krankheit hinweisen können., Einige der beliebtesten Techniken, die RNA-seq verwenden, sind Transkriptionsprofilierung, SNP-Identifizierung, RNA-Bearbeitung und differentielle Genexpressionsanalyse3.
Dies kann Forschern wichtige Informationen über die Funktion von Genen geben. Zum Beispiel kann das Transkriptom alle Gewebe hervorheben, in denen ein Gen unbekannter Funktion exprimiert wird, was auf seine Rolle hinweisen könnte. Es erfasst auch Informationen über alternative Spleißereignisse (Abbildung 1), die verschiedene Transkripte aus einer einzelnen Gensequenz erzeugen. Diese Ereignisse würden nicht durch DNA-Sequenzierung erfasst., Es kann auch post-transkriptionelle Modifikationen identifizieren, die während der mRNA-Verarbeitung auftreten, wie Polyadenylierung und 5′ capping2.
Abbildung 1: Die Verwendung von RNA-seq-Daten verwendet kurze Lesevorgänge von mRNA, die frei von intronischer nichtkodierender DNA ist. Diese Lesevorgänge müssen dann wieder auf das Referenzgenom ausgerichtet werden.
Wie funktioniert RNA-seq?
Frühe RNA-seq-Techniken verwendeten die Sanger-Sequenzierungstechnologie, eine Technik, die zu dieser Zeit zwar innovativ war, aber auch einen geringen Durchsatz hatte, kostspielig und ungenau war., Erst vor kurzem, mit dem Aufkommen und der Verbreitung der NGS-Technologie, konnten wir das Potenzial von RNA-seq voll ausnutzen4.
Der erste Schritt in der Technik beinhaltet die Umwandlung der Population von RNA in cDNA-Fragmente (eine cDNA-Bibliothek) sequenziert werden. Dadurch kann die RNA in einen NGS-Workflow eingefügt werden. Adapter werden dann an jedem Ende der Fragmente hinzugefügt. Diese Adapter enthalten funktionale Elemente, die eine Sequenzierung ermöglichen; beispielsweise das Verstärkungselement und die primäre Sequenzierungsstelle., Die cDNA-Bibliothek wird dann von NGS analysiert und erzeugt kurze Sequenzen, die entweder einem oder beiden Enden des Fragments entsprechen. Die Tiefe, auf die die Bibliothek sequenziert wird, hängt von den Techniken ab, für die die Ausgabedaten verwendet werden. Die Sequenzierung folgt oft entweder Single-Read – oder Gepaart-End-Sequenzierungsmethoden. Die Single-Read-Sequenzierung ist eine billigere und schnellere Technik (als Referenz etwa 1% der Kosten der Sanger-Sequenzierung), die die cDNA von nur einem Ende aus sequenziert, während gepaarte Endmethoden von beiden Enden sequenzieren und daher teurer und zeitaufwändiger sind5, 6.,
Es muss eine weitere Wahl zwischen strangspezifischen und nicht strangspezifischen Protokollen getroffen werden. Die erstere Methode bedeutet, dass die Information darüber, welcher DNA-Strang transkribiert wurde, beibehalten wird. Der Wert zusätzlicher Informationen aus strangspezifischen Protokollen macht sie zur günstigen Option.
Diese Lesevorgänge, von denen es am Ende des Workflows viele Millionen geben wird, können dann an einem Referenzgenom ausgerichtet und zu einer RNA-Sequenzkarte zusammengestellt werden, die das Transkriptom überspannt7.,
RNA-seq vs Microarrays: Warum RNA-seq als überlegen gilt
RNA-seq wird allgemein als überlegen gegenüber anderen Technologien wie der Mikroarray-Hybridisierung angesehen. Es gibt mehrere Gründe für den angesehenen Status von RNA-seq
Eine RNA-seq-Protokollexperimentsplanung
Vorbereitung vor Beginn Ihres RNA-seq-Experiments ist unerlässlich. Fragen, die vor dem Start von include10 zu beantworten sind:
•Welche Methode zur RNA-Reinigung verwenden Sie?
•Wie viele Lesevorgänge benötigen Sie?
•Welche Plattform nutzen Sie?,
•Welches Referenzgenom werden Sie verwenden?
•Wie beurteilen Sie die Qualität Ihrer RNA?
•Müssen Sie Ihre Ziel-RNA anreichern?
•Werden Sie Ihre RNA Barcode?
•Habe ich genug biologische und technische Replikate?
•Single-read-oder paired-end-Sequenzierung?
Vorbereitung der cDNA-Bibliothek
Nachdem diese Punkte berücksichtigt wurden, können Sie mit der Vorbereitung Ihrer cDNA-Bibliothek beginnen. Dies erfordert das Hinzufügen der plattformspezifischen „Adaptersequenzen“ und die Amplifikation der DNA, aber das genaue Verfahren wird sehr spezifisch für die Plattform sein, die in diesem Stadium verwendet wird., Die Amplifikation der DNA beinhaltet eine reverse Transkriptase-vermittelte erste Strangsynthese, gefolgt von einer DNA-Polymerase-vermittelten zweiten Strangsynthese10, 11.
cDNA-Sequenzierung
Sobald die Bibliothek vorbereitet und hinzugefügt wurde, können Sie die von Ihnen gewählte Sequenzierungsplattform verwenden, um Ihre cDNA-Bibliothek in die gewünschte Tiefe zu sequenzieren. Sobald Ihre Transkriptdaten erstellt wurden, können Sie die Daten Ihrem Referenzgenom zuordnen., Der Ausrichtungsprozess kann durch das Vorhandensein von Spleißvarianten und-modifikationen kompliziert sein, und die Wahl des verwendeten Referenzgenoms variiert auch, wie schwierig dieses Stadium ist. Softwarepakete wie STAR sind in diesem Stadium ebenso nützlich wie Qualitätskontrollwerkzeuge wie Picard oder Qualimap12.
RNA-Seq-Datenanalyse
Nach der Ausrichtungsphase können Sie sich auf die Analyse Ihrer Daten konzentrieren. Tools wie Sailfish, RSEM und BitSeq12 helfen Ihnen dabei, Ihre Expressionsniveaus zu quantifizieren, während Tools wie MISO, die alternativ gespleißte Gene quantifizieren, für spezialisiertere Analyse13 zur Verfügung stehen., Es gibt eine Bibliothek dieser Tools, und das Lesen von Bewertungen und Zusammenfassung ist der beste Weg, um das richtige Werkzeug für Ihre Forschung zu finden.
Zusammenfassend ist die moderne RNA-seq als überlegene Option für Mikroarrays gut etabliert und wird wahrscheinlich vorerst die bevorzugte Option bleiben.
5.https://systemsbiology.columbia.edu/genome-sequencing-defining-your-experiment
6.https://emea.illumina.com/science/technology/next-generation-sequencing/paired-end-vs-single-read-sequencing.html
9.https://cofactorgenomics.com/advantages-rna-seq-over-microarray-technology/
10.http://bioinformatics.ucdavis.edu/docs/2015-june-workshop/_downloads/Th_MB_RNASeq_Intro.pdf
11.https://rnaseq.uoregon.edu/#library-prep-stranded-libraries