Tiere
Alle Experimente wurden mit männlichen und weiblichen C57/B6-Mäusen ohne Züchter durchgeführt (2-3 Monate alt). Jedes Geschlecht trug ungefähr zur Hälfte zur Gesamtzahl der Tiere in jedem Experiment bei. Die Tiere wurden in einem 12/12 h Dunkel/Hell-Zyklus untergebracht und hatten uneingeschränkten Zugang zu Nahrung und Wasser., Die Verwendung von Mäusen in diesen Experimenten war in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren und experimentelle Protokolle wurden von der University of Southern California Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt.
Lichtexposition
Die Augen wurden mit 0,5% Tropicamid-Ophthalmallösung, USP (AKORN) und 2,5% Phenylephrinhydrochlorid-Ophthalmallösung, USP (AKORN) erweitert. Die Mäuse waren über Nacht dunkel angepasst., Sie wurden 30 min bis 1 h in Dunkelheit gehalten oder einem diffusen kühlweißen Fluoreszenzlicht bei einer Lumineszenz von 5000 Lux ausgesetzt, bevor sie eingeschläfert wurden. Die dunkelangepassten Proben für beide Methoden wurden in einem Dunkelkammer unter Infrarotlicht hergestellt und alle Verfahren mit dunkelangepasstem Gewebe wurden unter Verwendung eines Seziermikroskops mit Infrarotwandlern durchgeführt (B. E. Meyers & Co, Inc.). Die lichtexponierten Proben wurden unter einem Sezierbereich im Raumlicht verarbeitet.,
Retina-Dissektion
Mäuse wurden durch Isofluran-Inhalation eingeschläfert, gefolgt von zervikaler Dislokation. Die Augen wurden enukleiert und die Netzhaut in einer 35 × 10 mm Petrischale isoliert, die mit dem unten beschriebenen geeigneten Puffer/Lösung gefüllt war. Hornhaut, Linse und Glaskörper wurden von jedem Auge entfernt und das pigmentierte Netzhautepithel (RPE) und die Sklera sorgfältig von jeder Netzhaut abgezogen. Die isolierten Netzhaut wurden mit einem Federskalpell in einer 60 × 15 mm Schale halbkreisförmig geschnitten und die Ränder wurden zugeschnitten, um zwei Rechtecke zu erzeugen., Die Minimierung der Krümmung jeder halbierten Netzhaut trug zur Abflachung der Netzhaut bei und sorgte für eine genaue Ablösung der Netzhautschichten. Das richtige Beschneiden der Faltkanten der Netzhaut ist unerlässlich: Wenn die Netzhaut auf dem Filterpapier Faltkanten aufweist, führt dies zu einer verringerten Ausbeute an isolierten ROS und ist vor allem mit anderen Netzhautschichten kontaminiert.
Immunzytochemie
Vor der Enukleation war der obere Pol der Hornhaut durch Kauterisation gekennzeichnet und Hornhaut, Linse und Glaskörper wurden anschließend entfernt., Die restlichen Augentassen wurden in 4% Paraformaldehyd in PBS für 15 min gegeben und 3 mal für 10 min in PBS gespült. Die Augenmuscheln wurden in 30% Saccharose in PBS für 2 h kryoprotektiert, in Tissue-Teck® O. C. T. Compound (Sakura Finetek, USA) gegeben und schnell in flüssiger N2 eingefroren. Die gefrorenen Blöcke wurden bei 10 µm in einem Kryostat (CM 3050 S, Leica Microsystems) durchtrennt und bei -80 °C gelagert.Vor der Antikörperinkubation wurden die Abschnitte 15 min lang auf Raumtemperatur (RT) ausgeglichen., Für die GNAT1-Färbung unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers TF-15 der Maus wurde eine Epitopentnahme durchgeführt: Abschnitte wurden 2 min RT mit 0,02 mg/ml Proteinase K im Blockierpuffer (2% Rinderserumalbumin, 2% Ziegenserum, 0,3% Triton X-100 in 1X PBS) behandelt und 10 s lang auf 65 °C erhitzt, gefolgt von fünf Spülungen mit PBS. Blocking-Puffer wurde dann auf alle Abschnitte 1. h. Abschnitte wurden entweder die Inkubation mit Kaninchen-Antikörper gegen ARR1 (C10C10, verdünnt 1:100 in blocking-Puffer) oder TF-15 (CytoSignal, verdünnt 1:200 in blocking-Puffer)., Die Abschnitte wurden gespült und mit einem fluoresceinmarkierten sekundären Antikörper inkubiert (Vector Laboratories). Alle Abschnitte wurden dann mit dem biotinylierten Antikörper gegen Rhodopsin doppelt gefärbt (1D4 verdünnt 1:300 im Blockierpuffer). Die Abschnitte wurden gespült und mit Rhodamine Avidin D inkubiert (1:100, Vector Laboratories). Die Bilder wurden mit einem Zeiss AxioPlan2-Mikroskop erhalten. Helle und dunkle Bedingungen wurden mit identischen Belichtungszeiten abgebildet.,
ROS-Sammlung durch sequentielles Peeling mit Filterpapier
Das Filterpapier-Peeling-Verfahren wurde von einer Technik angepasst, um fluoreszenz markierte bipolare Zellen in einer Netzhautflachhalterung für Patch-Clamp-Aufnahmen freizulegen . Durch das Abziehen der Mehrfachschichten der Photorezeptorzelle mit Filterpapier werden die bipolaren Zelldendriten und Zellkörper allmählich freigelegt, um den Zugang für elektrische Stimulation und Patch-Clamp-Messwerte zu erleichtern. Wir fanden heraus, dass die geschälten Nebenprodukte, die Photorezeptorschichten, die auf dem Filterpapier haften bleiben, für nachfolgende Western-Blot-Analysen geeignet waren.,
Ames ‚ Medium wurde zur Manipulation von lebendem Netzhautgewebe verwendet (Sigma-Aldrich A1420). Es wurden zwei verschiedene Puffer hergestellt: Ames ‚- HEPES (zu 1 L 2,38 g HEPES, 0,877 g NaCl, pH 7,4) und Ames ‚ – Bicarbonat (zu 1 L 1,9 g NaHCO3, pH 7,4). Beide wurden im Voraus vorbereitet, steril gefiltert und bei 4 °C gelagert.Alle Verfahren wurden bei RT durchgeführt., Vor der retinalen Dissektion wurden 50-100 ml Ames‘-HEPES mit 100% O2 in einer GibcoTM 100 ml Medienflasche (Thermo Fisher, USA) und 50-100 ml Ames‘-Bicarbonat mit 95% O2 und 5% CO2 in einem lichtdichten Behälter für 15-20 min vor Gebrauch gesprudelt.
Retinas wurden wie im Abschnitt „Retina-Dissektion“ beschrieben hergestellt und in einem lichtdichten Behälter mit Ames-Bicarbonat, das mit 95% O2 und 5% CO2 gesprudelt ist, gelagert, um den physiologischen pH-Wert aufrechtzuerhalten., Dieser Inkubationszustand ist identisch mit dem Zustand, der von Netzhautphysiologen für Ex-vivo-Elektroretinogrammaufzeichnungen oder Saugelektrodenaufzeichnungen verwendet wird, und kann die Lebensfähigkeit und Funktionalität des Gewebes für mehrere Stunden aufrechterhalten. Für jeden Schälvorgang wurde ein halbiertes Stück rechteckig getrimmter Netzhaut verwendet. Das Gewebe wurde über eine 1,7 ml Kunststoff-Transferpipette (Spitze geschnitten) in eine 35 × 10 mm Petrischale mit sauerstoffhaltigen Ames‘ – HEPES überführt. Das Medium wurde während des Schälvorgangs alle 10 min aktualisiert, um den sauerstoffhaltigen Zustand aufrechtzuerhalten., Die Netzhaut in Lösung wurde mit der Photorezeptorseite nach unten mit einer Pinzette und der Transferpipette ausgerichtet. Ein 5 mm × 2,5 mm rechteckiges Stück Filterpapier aus VWR Grade 413 Filterpapier (Durchmesser 5,5 cm, Porengröße 5 µm, VWR, USA) wurde in die Petrischale neben der Netzhaut gelegt. Die Netzhaut wurde vorsichtig mit einer Pinzette (leicht an den Rändern haltend) mit der Photorezeptorseite nach unten auf das Filterpapier bewegt. Sobald die Netzhaut auf dem Filterpapier zentriert war, wurden beide vorsichtig aus dem Ames-HEPES gehoben., Die Unterseite des Filterpapiers (die Seite ohne Netzhaut) wurde auf ein Papiertuch aufgetragen, um die Flüssigkeit auf dem Filterpapier aufzusaugen (2-3 Tupfen). Dies erzeugte eine sichere Haftung zwischen den Photorezeptorzellen und den Fasern des Filterpapiers, und diese Befestigung war wichtig, um die ROS-Schicht zu entfernen. Ein Tropfen Ames ‚ – HEPES aus der Petrischale wurde auf die Netzhaut gelegt und das Filterpapier wieder auf das Papiertuch aufgetragen. Dies wurde insgesamt dreimal wiederholt., Das Filterpapier mit der Netzhaut wurde dann wieder in die Petrischale gelegt und untergetaucht, und das Gewebe aus dem Filterpapier mit einer Pinzette entfernt. Es wurde darauf geachtet, nur den äußersten Umfang der Netzhaut zu berühren, um die strukturelle Integrität der Netzhaut zu erhalten. Um den Schälvorgang zu erleichtern, wurden die Ränder der Netzhaut von jeder Seite sanft vom Filterpapier abgezogen, wodurch die Haftung der Netzhaut am Filterpapier gelöst wurde., Sobald die Netzhaut aus dem Filterpapier entfernt wurde, wurde die Unterseite des Filterpapiers auf einem Papiertuch abgetupft und in eine Röhre mit der Bezeichnung +ROS gelegt und auf Eis gehalten. Der oben beschriebene Schälvorgang wurde ungefähr 7-8 mal wiederholt. Nach 5 Peelings wurde die Netzhaut dünner, transparenter und rissanfälliger. Nach dem Schälen wurde das +ROS-Röhrchen mit den gesammelten Filterpapieren und den restlichen geschälten Hälften in das-ROS-Röhrchen gegeben, auf Trockeneis eingefroren und bei -80 °C gelagert.,
Trennung von Photorezeptorkompartimenten durch Ablösen lyophilisierter Netzhaut
Diese Methode wurde von der von M. E. Guido, et al. , wer hat ein ScotchTM tape peeling-Methode, die genutzt gefriergetrocknetes Küken, die Netzhaut selektiv trennen Sie die Netzhaut in verschiedene Schichten (photorezeptorzellen, inner nuclear layer, und Ganglienzellen)., Da Netzhaut aus verschiedenen Tiermodellen unterschiedliche Stäbchen – und Kegelverteilungen aufweisen und sich nach der Lyophilisierung asymmetrisch mit Klebeband trennen können, haben wir diese Methode angepasst und ihren Nutzen für die Trennung von Stäbchenkompartimenten von Maus-Netzhaut untersucht.
Gefriertrocknung isolierter Netzhaut
Netzhaut wurde wie im Abschnitt „Netzhautdissektion“ beschrieben hergestellt. Kalter Ringer – (130 mM NaCl, 3.6 mM KCl, 2,4 mM MgCl2, 1,2 mM CaCl2, 10 mM HEPES, 0.02 mM EDTA, pH 7,4) wurde während der Präparation. Andere physiologische Puffer, wie Ames‘-HEPES, könnten ebenfalls verwendet werden., Da häufig mehrere Proben gleichzeitig behandelt wurden, wurden die 5 × 2,5 mm Filterpapierteile (Whatman® Grade 1 Qualitatives Filterpapier (Durchmesser 9 cm, Porengröße 11 µm, GE Healthcare, USA)) vorzeitig beschriftet, bevor sie in eine Petrischale gefüllt mit kaltem Ringerpuffer gegeben wurden. Für jede Probe wurde ein halbiertes, rechteckiges Stück Netzhaut auf dem Filterpapier mit einer 1,7 ml Transferpipette (Schnittspitze) mit der Ganglienzellenseite nach unten und der Photorezeptoraußensegmentseite nach oben positioniert., Sobald das Gewebe auf dem Filterpapier zentriert war, wurden beide aus dem Ringerpuffer gehoben und der Boden des Filterpapiers (die Seite ohne Netzhaut) wurde auf ein Papiertuch (2-3 Tupfen) getupft, um die Befestigung der Ganglienzellenschicht auf dem Filterpapier zu erleichtern. Ein Tropfen kalter Ringer wurde auf die Netzhaut gelegt, und der Filterpapierboden wurde erneut auf das Papiertuch aufgetragen. Dies wurde insgesamt dreimal wiederholt. Der Ringer-Puffer wurde nach jeder Probenvorbereitung gegen einen neuen kalten Ringer-Puffer ausgetauscht., Das Filterpapier mit angeschlossener Netzhaut wurde in eine Petrischale gefüllt mit kalten Ringer ‚ s gelegt, bis alle Proben auf die gleiche Weise verarbeitet wurden. Schließlich wurde jeder wieder aus der Lösung gehoben, der Boden des Filterpapiers trocken abgetupft und ein Tropfen kaltes PBS auf das Filterpapier neben der Netzhaut gelegt, der Boden des Filters wieder abgetupft und in eine saubere und trockene 35 × 10 mm Petrischale gegeben. Der Zweck dieses Schritts war es, die komplexeren Ringer mit PBS abzuspülen, um die Menge an getrocknetem Salz auf dem lyophilisierten Gewebe zu reduzieren., Nachdem alle Gewebeproben mit diesem letzten Spülschritt verarbeitet und in der sauberen Petrischale gesammelt worden waren, wurde die Schale mit zwei Schichten von 2,5 × 2,5 Zoll quadratischen Aluminiumfolienstücken mit kleinen Löchern leicht fest umwickelt, so dass die dunkel angepassten Netzhautproben nicht Licht ausgesetzt und schnell in Flüssigkeit N2 eingefroren wurden. Die kleinen Löcher ermöglichten den Zugang von flüssigem N2 in den Innenraum, füllten die Petrischale und es wurde darauf geachtet, dass die Löcher versetzt waren, so dass die Petrischale lichtdicht eingewickelt war., Die Petrischale wurde dann in einen 600 ml Labconco-Kolben unter Verwendung eines VirTis Benchtop 2 K Lyophilisators (SP Scientific, USA) für 30 min gegeben, um das Gewebe zu lyophilisieren.
Abblättern der Netzhautschichten durch Klebeband
Gefriergetrocknetes Netzhautgewebe wurde bei -80 °C in einem mit DrieriteTM (W. A. Hammond Drierite Co, USA) gefüllten Behälter gelagert oder als +ROS, +RIS und-ROS/RIS-depleted tissue (-OIS) isoliert, wie oben beschrieben wieder eingefroren oder am selben Tag für Western Blots verarbeitet. Alle Peeling-Verfahren wurden unter Raumbeleuchtung durchgeführt. Streifen kleiner als 2.,5 mm Breite wurden geschnitten und auf den Rand des Bandspenders gelegt, bis sie in rechteckige Stücke geschnitten wurden. Eine auf Whatman® Filterpapier fixierte lyophilisierte Netzhaut wurde in eine saubere 10 cm Petrischale gegeben. Ein kleines rechteckiges Stück Klebeband (etwas größer als die Oberfläche des Gewebes) wurde geschnitten und sorgfältig auf die lyophilisierte Netzhaut gelegt. Das Auflegen des Bandes auf die lyophilisierte Netzhaut reichte fast aus, um die orange getönte ROS-Schicht am Band zu befestigen., Um einen vollständigen Kontakt des ROS mit dem Band zu gewährleisten, wurde ein leichter Druck mit einer Pinzette auf die Oberseite des Bandes ausgeübt, um den Kontakt mit der Oberseite sicherzustellen. Nach sorgfältigem Abziehen des Bandes wurde die orange getönte ROS-Schicht auf das Band geklebt und vom Rest der Netzhaut getrennt. Diese Fraktion wurde mit +ROS beschriftet und in ein sauberes Mikrofugenrohr gegeben. Oft war ein dünner, weißer Film an der gebrochenen Oberfläche der Orangenschicht auf der ersten Bandschale sichtbar., Diese Oberfläche wurde durch weitere Bandschalen entfernt, bis sie vollständig entfernt und die orange Farbe der ROS-Schicht an die Oberfläche gebracht wurde. Diese weiße Schicht, die ursprünglich an ROS befestigt war, wurde in ein separates Röhrchen gelegt und mit +RIS-Fraktion gekennzeichnet. Band wurde verwendet, um das übrig gebliebene Netzhautgewebe aus dem Filterpapier zu entfernen und wurde in eine Tube mit der Bezeichnung-OIS gelegt., Die Menge an Druck, die auf das Band für die anfängliche Ablösung der orange getönten ROS-Schicht ausgeübt wurde, beeinflusste, wie die lyophilisierte Probe zerbrach; Zu viel Druck führte dazu, dass die gesamte lyophilisierte Netzhaut das Filterpapier auf das Band abzog und zu wenig Druck die obere Orangenschicht nicht von der Netzhaut trennte. Ein paar Durchgänge über das Band mit minimalem Druck mit einer Pinzette waren hilfreich, um den minimalen und maximalen Druck zu spüren, der auf die Oberseite des Bandes ausgeübt werden musste.,
Probenvorbereitung für Western Blot: Schälen mit Filterpapier
Die +ROS-Röhrchen mit den Filterpapieren wurden 2 s lang in einer Mikrozentrifuge schnell gedreht und die überschüssige Flüssigkeit entfernt. Jede Röhre wurde einzeln bearbeitet (eine halbierte Netzhaut) oder zwei Röhren (zwei halbierte Netzhaut) wurden für konzentrierteres Material kombiniert. Das + ROS-Isolat in einem einzigen Röhrchen wurde in 45-60 µL kaltem RIPA-Pufferpuffer homogenisiert (50 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1% Natriumdesoxycholat, 0.1% SDS, 1 mm EDTA, 0.,1 M PMSF, kompletter Miniproteaseinhibitor (Roche Applied Sciences)) und The-ROS-Isolat in einem einzigen Röhrchen wurden in 80-100 µL RIPA-Puffer homogenisiert. Wenn zwei Röhren kombiniert wurden, wurden 80-110 µL kalter RIPA-Puffer verwendet, um +ROS zu homogenisieren, und 100-150 µL kalter Puffer wurde für-ROS verwendet. Alle Röhrchen wurden 1 min mit einem autoklavierten Stößel homogenisiert. Es wurde sehr darauf geachtet, dass die Filterpapierteile in den +ROS-Rohren seitlich an den Rohren gehalten wurden und mit dem Stößel in Kontakt blieben, anstatt am Boden zu stecken., Nach der Homogenisierung wurden sterile Pinzetten verwendet, um die Filterpapierstücke zur Seite des +ROS-Röhrchens zu bewegen, gefolgt von 2-4 s Spin in der Mikrozentrifuge. Dieser Spin extrahierte die Flüssigkeit aus dem Papier, und die Flüssigkeit wurde in ein sauberes Rohr übertragen und für Western Blot verarbeitet, wie unten beschrieben. Dies war der zeitaufwändigste Schritt, und wenn er nicht richtig durchgeführt wurde, kann ein Großteil der Probe von den Filterpapierstücken absorbiert werden. Um die Rückgewinnung der Probe zu maximieren, sollte die Größe der für die Peelings verwendeten Filterpapierstücke auf die Fläche des Netzhautgewebes zugeschnitten werden.,
Probenvorbereitung: Peeling mit ScotchTM tape
Ähnlich wie bei der Filterschälmethode wurden zwei Röhrchen, die jeweils eine geschälte Schicht aus einer halben Netzhaut enthielten, kombiniert, um die Proteinkonzentration zu erhöhen. +ROS-und + RIS-Proben wurden in 100-115 µL und-OIS-Proben in 125 µL kaltem RIPA-Puffer homogenisiert. Alle Röhrchen wurden für 1 min homogenisiert. Es wurde sehr sorgfältig darauf geachtet, dass das Band in den Rohren +ROS, +RIS und-OIS in Kontakt mit dem Stößel blieb und dass das Band an der Seite der Rohre gehalten wurde, anstatt am Boden zu kleben., Nach der Homogenisierung wurden sterile Pinzetten verwendet, um Bandstücke zur Seite der Röhrchen zu bewegen. Die Röhrchen wurden in der Minizentrifuge für 2-4 s gesponnen, wonach die getrockneten Bandstücke vorsichtig entfernt wurden.
Proteinquantifizierung, Gelelektrophorese und Proteinimmunoblots
Zur Bestimmung der Gesamtproteinmenge in jeder Probe wurde ein BCA-Protein-Assay-Kit (Thermo Scientific, USA) verwendet. Zwei Mikroliter DNaseI (10 Einheiten / µL, Roche, Schweiz) wurden den Proben zugesetzt und 30 min bei Raumtemperatur belassen., Dem Homogenat wurde ein geeignetes Volumen von 4X SDS-Probenpuffer (40% Glycerin, 240 mM Tris-Basis pH 6,8, 8% SDS, 5% ßME, 0,04% Bromophenolblau) zugesetzt.,tr>
Approximately 10 μg of protein lysate was loaded per lane and separated on a pre-cast polyacrylamide Bis-Tris gel with a 4–12% gradient (Life Technologies, USA) and transferred onto nitrocellulose membrane., Die Membranen wurden in 10% Milch/TBS-T-Puffer für 1 h bei RT blockiert und über Nacht mit den folgenden Antikörpern inkubiert: Kaninchen-Anti-ARR1-Antikörper (1: 1000, ref), Maus-Anti-GNAT1-monoklonaler Antikörper (TF-15, 1: 1000, CytoSignal), Kaninchen-Anti-β-Aktin-Antikörper (1: 5000, GeneTex Inc.), Kaninchen-anti-RGS9-Antikörper (1:1000), Kaninchen-anti-Gß5L/S (CT215) (1:2000) und Kaninchen-anti-Cytochrom-C-polyklonaler Antikörper (1:500, Santa Cruz, sc-7159). Membranen wurden mit fluoreszenzmarkierten sekundären Antikörpern (1:10.000, LI-COR Biosciences) bei RT für 1 h inkubiert., Die Proteinbänder wurden mittels Odyssey® infrared Imaging System (LI-COR Biosciences, USA) nachgewiesen und die Fluoreszenzintensität einzelner Bänder mittels ImageJ quantifiziert. GNAT1 -, ARR1 – und RGS9-Signale wurden gegen Gß5L für +ROS -, +RIS-Proben und gegen Actin für-ROS-und-OIS-Proben normalisiert. Für jedes unabhängige Experiment wurden Fluoreszenzsignale für jedes Protein in jedem Kompartiment auch gegen kombinierte Signale aus allen Netzhautkompartimenten normalisiert. Ungepaarte 2-tailed T-Tests wurden verwendet, um Unterschiede zwischen zwei Gruppen zu bestimmen.