Differentielle Migration von Holo – und Apo-Metalloproteinen durch MICS-BN-PAGE
Während bei herkömmlichen Polyacrylamidgelelektrophorese durch CBB – Farbstoff keine Trennung von Holo-(Fe2-Transferrin (Tf)) und apo-Tf beobachtet wurde 1D native (CBB G-250 frei) – SEITE (Abb. 1a) und SDS-SEITE (Abb., 1b), interessanterweise fanden wir heraus, dass Holo-und Apo-Tf durch MICS-BN-PAGE vollständig getrennt sind (Abb. 1c) (es sei darauf hingewiesen, dass für eine „reine“ Apo-Tf-Probe mit BN-PAGE ohne Mikrofonmodus aufgrund einer Metallionskontamination zwei Bänder beobachtet wurden; Ergänzende Abb. S1). In SDS-PAGE ist dies wahrscheinlich auf die Dissoziation von Metallionen von Holo-Formen zurückzuführen, die unter starken Denaturierungsbedingungen auftreten14, 15 (Daten nicht gezeigt). Diese Tatsache legt nahe, dass die elektrophoretische Erkennung zwischen Holo – und Apo-Formen für herkömmliche Seitenverfahren nicht verfügbar ist., Diese Ergebnisse implizieren, dass spezifische schwache Denaturierungsmittel, wie CBB-G 250, die in MICS-BN-PAGE eingesetzt werden, den Unterschied zwischen Holo – und Apo-Metalloproteinen erkennen, um die Trennung zu verbessern und eine Metalldissoziation zu vermeiden.
Auch bei Ceruloplasmin (Cp), gebunden mit Cu2+ (Cu – Cp) und Superoxiddismutase (SOD), gebunden mit Cu2+ und Zn2+ (Cu/Zn-SOD), wurden unterschiedliche Migrationsverhalten für Holo-und Apo-Formen nach der MICS-BN-PAGE-Methode beobachtet (Abb. 1d,e). Apo-Formen wanderten zu Positionen in enger Übereinstimmung mit ihren genauen Molekulargewichten in MICS-BN-PAGE (Abb., 1: Tf, 77 kDa; Cp, 134 kDa; SOD, 32 kDa), was nützlich ist, wenn die Identifizierung der Proteine. Wie im Einführungsabschnitt beschrieben, führten diese Ergebnisse dazu, dass wir die Holo/apo Conversion (HAC)-2D MICS-BN-PAGE Methodik zur selektiven Isolierung von Holo-Metalloproteinen entwickelten.
Konzept der Holo / apo-Konvertierung 2D MICS-BN-PAGE
Unsere neue 2D – PAGE-Methode, die auf der differentiellen Migration zwischen Holo-und Apo-Metalloproteinen basiert, beginnt mit einer MICS-BN-PAGE-Phase, die in zwei Spuren durchgeführt wird (Spuren A und B in Abb., 2, Panel I), um die Trennung von Holo – und Apo-Metalloproteinen aus einer Probe zu ermöglichen, die beide Metalloproteinformen enthält. Die beiden Fahrspuren werden dann nach der anfänglichen MICS-BN-PAGE-Trennung zwei verschiedenen Behandlungen unterzogen: Spur A wird einer zweiten MICS-BN-PAGE-Stufe unterzogen, jedoch erst nach einer Holo / Apo-Conversion-Behandlung (Abb. 2 panel II-1); während Spur B an eine Metalldetektionsseitenstufe geliefert wird, um die Metallionen zu bestimmen, die mit den getrennten Proteinen assoziiert sind (Abb. 2 tafel II-2). Die Behandlung auf Spur B wurde zuvor validiert., Beispielsweise wurde die Bestimmung einiger Schwermetallionen (Cu2+, Fe3+, Co3+, Ni2+, Mn2+ und Cd2+) in Proben mit kleinem Volumen (µL) bei ppt-und Sub-ppb-Werten durch dieses PAGE-Verfahren ohne Verwendung eines Reinraumes gemeldet21. Darüber hinaus zeigte diese Tandem 1D MICS-BN-PAGE/Metal Detection PAGE-Methodik die genaue Verteilung von Cu2+ im menschlichen Serum auch für schwach albumingebundenes (austauschbares) Cu2+ 21 und schlug vor, dass das periplasmatische Rubrivivax Gelatinosus CopI-Protein, das stark an der Kupferresistenz beteiligt ist, ein kupferbindendes Protein ist22., Dennoch ist es aufgrund von co-wandernden Proteinen schwierig, metallgebundene Proteine in einer komplexen Proteinprobe vollständig zu identifizieren. Zum Beispiel wurde nicht vollständig nachgewiesen, dass CopI ein kupferbindendes Protein in R. gelatinosus ist, obwohl seine Sequenz drei mutmaßliche Cu-Bindungsstellen aufweist: (i) ein Kupferzentrum vom Typ 1, das in vielen Cupredoxinen wie Azurin und Plastocyanin vorhanden ist, (ii) eine histidinreiche N-Terminus-Sequenz und (iii) eine Histidin/Methionin-reiche Sequenz. CopI-verwandte Proteine sind in vielen Bakterien vorhanden, aber nicht weit konserviert; Zum Beispiel fehlt es an Escherichia coli22., Bisher wurden nur die Proteine von R. gelatinosus und Vibrio cholerae untersucht und sind an der Cu-Resistenz beteiligt22,23. In R. gelatinosus wird CopI-Protein in Gegenwart von Cu2 + stark exprimiert; Der Cu-Entgiftungsmechanismus ist jedoch noch unbekannt. Somit ist ein Verfahren zur Isolierung von Metalloproteinen aus allen anderen Proteinen erforderlich, die in komplexen biologischen Proben koexistieren.
Konzept der HAC-2D-Mikrofone-BN-PAGE/Metall-Erkennung SEITE Methodik., Panel I: 1D-Mikrofone-BN-SEITE in zwei Fahrspuren. Lane A wurde dem In-Gel Holo/Apo-Umwandlungsverfahren unterzogen (wie in Panel II-1), und dann wurde Lane A 2D MICS-BN-PAGE nach Holo/Apo-Konvertierung unterzogen (wie in Panel III). Spur B wurde Cu2+ und Fe3+ Detektionsseite unterzogen (wie in Panel II-2). Das 2D-Elektropherogramm ist für eine Mischung von Metalloproteinen (Holo-Tf, apo-Tf, Holo-Cp und Holo-SOD) bestimmt, bei denen Holo-Metalloproteine in der Originalprobe als Flecken außerhalb der diagonalen Linie isoliert wurden (die gepunktete gelbe Linie in Panel III). Full-Size-Versionen von Elektropherogrammen in Abb., 2 sind in Abb. S2.
Um diese Einschränkung zu überwinden, werden die Informationen der 1D MICS-BN-PAGE/metal Detection PAGE-Analyse von Lane B erweitert, indem Lane A nach Holo/apo-Konvertierung einer zweiten Dimension von MICS-BN-PAGE unterzogen wird. Um diese Analyse durchzuführen, wird Spur A zunächst in eine saure Metallchelaturlösung eingeweicht(siehe Abschnitt Methoden und ergänzend für die detaillierten Bedingungen) für die Holo / Apo-Umwandlung (Abb. 2 tafel II-1)., Dabei werden die Holo-Metalloproteine im Gel der ersten Seitendimension zu metallfreien Apo-Metalloproteinen derivatisiert. Die behandelte Spur A wird dann mit Hilfe eines metallfreien Agarosegels an die zweite MICS-BN-PAGE-Stufe abgegeben (siehe ergänzende Informationen). In der zweiten MICS-BN-PAGE-Stufe (Abb. 2, Panel III) wandern Apo-Metalloproteine und Nichtmetalloproteine aus der ursprünglichen Probe auf der diagonalen Linie, da die Migration dieser Arten in der zweiten Seitendimension vollständig mit ihrer Migration in der ersten Seitendimension identisch ist., Auf der anderen Seite wandern Holo-Metalloproteine aus der ursprünglichen Probe unterschiedliche Entfernungen in der ersten und zweiten MICS-BN-PAGE-Dimension, da diese Proteine als Holo-Formen in der ersten Dimension und als Apo-Formen in der zweiten Dimension migrieren (und da MICS-BN-PAGE zu einer anderen elektrophoretischen Mobilität für Holo – und Apo-Formen von Metalloproteinen führt; vide infra). Somit wandern nur Holo-Metalloproteine aus der ursprünglichen Probe in der zweiten Dimension von der diagonalen Linie ab, um durch MALDI-TOF MS ohne zusätzliche Proteinreinigung identifiziert zu werden., Die Arten und Mengen von Metallionen, die mit Metalloproteinen in der ursprünglichen Probenlösung gebunden sind (die als off-diagonale Flecken isoliert sind), können wie oben beschrieben durch Metalldetektionsseite von Spur B bestimmt werden. Daher sind Informationen zur Identifizierung und Verteilung von Metalloproteinspezies zusammen mit den Identitäten und Konzentrationen von Metallionen, die sie binden, über diese neue HAC-2D MICS-BN-PAGE/Metal Detection PAGE-Methode zugänglich.,
Selektive Isolierung von Metalloproteinen in HAC-2D MICS-BN-PAGE
Zum Proof-of-Concept wurde die HAC-2D MICS-BN-PAGE/metal Detection PAGE für ein Probengemisch demonstriert, das Holo-Tf -, apo-Tf -, Holo-Cp-und Holo-SOD-Proteinstandards enthält (was das 2D-Elektropherogramm in Abb. 2, Panel III) und auch für eine menschliche Serumprobe (Ergänzende Abb. S3). Flecken von Holo-Metalloproteinen, die von der Diagonallinie wanderten, wurden erfolgreich für die gemischte Proteinprobe beobachtet., Zusätzlich wurde Fe3+ an der Position von Holo-Tf und Cu2+ an den Positionen von Holo-Cp und Holo-SOD in der ersten MICS-BN-PAGE-Stufe unter Verwendung der Metalldetektionsseite detektiert. Wenn keine Holo / Apo-Umwandlung durchgeführt wird, wandern alle Proteine auf der diagonalen Linie (Siehe Abb. S5). Für eine menschliche Serumprobe wurden Holo-Tf und Holo-Cp erfolgreich nachgewiesen (Ergänzende Abb. S3)., Somit wurde der Schluss gezogen, dass HAC-2D MICS-BN-PAGE / Metal Detection PAGE für die Isolierung von Holo-Metalloproteinen und die Identifizierung von Metallionen, die ursprünglich an Metalloproteine in einem Proteingemisch gebunden waren, sehr effektiv ist.
Schließlich wurde die HAC-2D MICS-BN-PAGE-Methode auf eine gesamte bakterielle lösliche Proteinfraktion angewendet, die aus R. Gelatinosuszellen gewonnen wurde, die in Gegenwart von 1,2 mm Cu2+ gezüchtet wurden und CopI-Protein exprimierten. Dies stellt eine biologische Proteinprobe dar., Für diese Stichprobe wurde ein Punkt außerhalb der diagonalen Linie an der Position von 100 kDa und 29 kDa auf der ersten bzw. zweiten SEITE gefunden (Abb. 3a). Eine hohe Konzentration von Cu2+ wurde an der Position von 97-139 kDa in der ersten MICS-BN-SEITE beobachtet (Abb. 3b). Folglich wurde der Schluss gezogen, dass das Protein an dieser Stelle Cu-Ionen gebunden hat. Die Stelle wurde geschnitten und anschließend durch MALDI-TOF-MS. Peptide entsprechend CopI identifiziert (Abb. 3c, Ergänzende Abb. S7 und Tabelle S1)., Wenn dieser Gelfleck auf SDS-PAGE ausgeführt wurde, wurde außerdem ein einzelnes Band CopI-Protein beobachtet (Daten nicht gezeigt). Ein weiterer Punkt außerhalb der Diagonallinie wurde bei etwa 40 kDa (über dem 29 kDa CopI-Punkt in der zweiten Dimension) beobachtet (Abb. 3a)). Es wurde von MALDI-TOF MS bestätigt, dass dieser Spot auch von CopI stammt (und wahrscheinlich ein Dimer von CopI entsprechend dem Molekulargewicht war). Somit könnte ein Metalloprotein spezifisch aus einem komplexen Proteingemisch isoliert werden, während auch sein gebundenes Metall identifiziert wird., Diese Analyse von HAC-2D MICS-BN-PAGE hat definitiv bewiesen, dass CopI ein Kupferbindungsprotein ist, und interessanterweise könnte diese Eigenschaft mit der Cu-Entgiftungsfunktion des Proteins im bakteriellen Periplasma zusammenhängen. Eine weitere quantitative Analyse ergab die Stöchiometrie von Cu-Ionen zu CopI als 1: 1 (basierend auf den Konzentrationen des gebundenen Cu-Ions (1,05 µM) und des Holo-CopI-Proteins (0,95 µM), wie durch CBB-R-250-Färbung bestimmt). Dies stimmt vollständig mit anderen experimentellen Ergebnissen überein, die eine Cu:CopI-Stöchiometrie von 1:1.2 unter Verwendung von ICP-MS mit reinem CopI (Durand et al.,, unveröffentlichte Daten). Dieses Ergebnis legt nahe, dass unsere Methode auch für Untersuchungen von Metalloprotein-Stöchiometrien nützlich ist.
HAC-2D MICS-BN-PAGE mit Silberfärbung (a), mit Cu2+ Nachweisseite (b), einer löslichen Fraktion, die aus R. Gelatinosus-Zellen gewonnen wird, die in Gegenwart von 1,2 mm Cu2+ (Gesamtprotein) gezüchtet wurden.: 31,5 µg). Die durch das Sternchen in (a) angegebene off-diagonale Stelle wurde MALDI-TOF MS unterzogen (Ergänzende Abb., S7), Identifizieren der in roter Schrift dargestellten Sequenzen als Teil der CopI-Reifesequenz (c). Full-Size-Versionen von Elektropherogrammen in Abb. 3 sind in der Abb. S8.
Kapillarelektrophorese Experimente zur Untersuchung molekularer Erkennungsmodi
Die Auflösungsverstärkung zwischen Holo-und Apo-Formen in Mikrofonen-SEITE mit CBB-Farbstoff unterstützt (Abb., 1c-e) ist ein wichtiger Schlüssel zu unserer Methodik, und interessanterweise scheint diese molekulare Erkennung von einer unterschiedlichen Anzahl von CBB G-250 – Farbstoffmolekülen zu stammen, die an jede der Holo-vs. Apo-Formen von Metalloproteinen binden. Dies wiederum führt wahrscheinlich zu unterschiedlichen effektiven Ladungen und / oder induzierten sterischen Strukturen für die Farbstoff-Protein-Komplexe. Beide Effekte würden sich auf die elektrophoretische Mobilität auswirken., Um einen tieferen Einblick in den Erkennungsmechanismus der CBB G-250 – Farbstoffbindung gegenüber Holo-und Apo-Tf zu erhalten, wurden CE-Experimente zusammen mit Docking-Simulationen unter Verwendung des AutoDock Vina program24, 25 (vide infra) durchgeführt. CZE wird in freier wässriger Lösung ohne Gelmatrix durchgeführt, so dass ein molekularer Siebeffekt in den Simulationen nicht berücksichtigt werden muss. Die von CZE gemessene elektrophoretische Beweglichkeit von Holo-Tf unterschied sich offensichtlich von der von Apo-Tf unter Zugabe des CBB-Farbstoffs (Abb. 4), während diese Proteine in Abwesenheit des Farbstoffs identische Mobilitäten aufwiesen., Diese Tatsache deutet stark darauf hin, dass die Anzahl der mit Holo – und Apo-Metalloproteinen gebundenen Farbstoffmoleküle unterschiedlich ist. In CZE würde die Migration des Protein-Farbstoff-Komplexes überwiegend durch die effektive Ladung des Komplexes beeinflusst, was wiederum durch die Anzahl der einzeln geladenen anionischen CBB-Farbstoffmoleküle beeinflusst würde, die an das Protein gebunden sind.,
Typische Elektropherogramme aus CZE – Experimenten für: 10 µM holo-oder apo-Tf ohne CBB G-250 (obere grüne Spur); und Mischungen mit 5 mM CBB G-250 Farbstoff mit 10 µM Holo-Tf (mittelblau spur) oder mit 10 µM apo-Tf (untere rote Spur).,
Traditionell wird die elektrophoretische Mobilität eines Proteins in freier Lösung durch die Henry-Gleichung dargestellt, wie in Gleichung (1) gezeigt:
Hier stellen Q, η, R und k die Nettoladung, die Lösungsviskosität, den Radius des Proteins und die inverse Debye-Länge der Elektrolytlösung dar. Die Henry-Funktion, H, erhöht sich monoton von 2/3 auf 1., Streng genommen gilt diese Formel ausschließlich für ein sphärisches Molekül mit einer zentrosymmetrischen Ladungsverteilung, obwohl es einige Diskussionen gibt, um die Henry-Gleichung so zu ändern, dass sie auf nicht sphärische Proteine mit komplexer Ladungsverteilung (einschließlich Dipol und Quadrupol)angewendet wird 26. In unserem Fall sind Holo-und Apo-Tf-Moleküle deformierte Kugeln sehr ähnlicher Größe(ähnlich Sphäroiden mit langen und kurzen Achslängen von etwa 92 und 60 Å (Holo-Tf) bzw. S9)., Zusätzlich wird erwartet, dass der Dipol und der Quadrupol nur einen geringen Einfluss auf die Mobilität haben, da die an Holo-/apo-Tf gebundenen CBB-G-250-Moleküle nicht lokalisiert sind, wie in der ergänzenden Abb. S9 (siehe unten). Die Ergebnisse präziser Berechnungen von Kim et al.26 zeigen, dass die elektrophoretische Beweglichkeit eines kugelförmigen Proteins durch einen Quadrupol in Lösungen mit geringer Ionenstärke nicht signifikant beeinflusst wird (I < 0,01 M), und die Ionenstärke des Trennpuffers in unseren CZE-Experimenten ähnlich niedrig war (I = 0,013 M).,
Somit wird das Verhältnis der elektrophoretischen Mobilitäten von Apo – und Holo-Tf, die mit CBB G-250-Farbstoff (nämlich µApo/µHolo) komplexiert sind, dem Verhältnis der Nettoladungen jedes Komplexes (nämlich QApo/QHolo) zugeschrieben, das leicht aus der Henry-Gleichung abgeleitet werden kann. Die negativen Nettoladungen von Tf-CBB-G-250-Komplexen stammen hauptsächlich aus der Bindungszahl des Farbstoffs. Folglich ergibt der Wert von µApo / µHolo auch das Verhältnis der Farbstoffzahlen (nämlich NApo/NHolo). Experimentell ist das Verhältnis der elektrophoretischen Mobilitäten der beiden Formen von Tf (µApo/µHolo = (-2.69 × 10-4)/(-2.,09 × 10-4)) wurde von CZE als 1,29 gefunden (Abb. 4), was dem Verhältnis der effektiven elektrischen Ladung entspricht, vorausgesetzt, die Größen beider Formen von Tf sind ähnlich. Daher sollte das Verhältnis der elektrophoretischen Mobilitäten mit dem Verhältnis der gebundenen Farbstoffmoleküle übereinstimmen. Eine weitere Diskussion des Zusammenhangs zwischen elektrophoretischer Mobilität und Proteinform für andere Metalloproteine ist jedoch erforderlich, wenn sich Holo – und Apo-Proteinformen unterscheiden (wie bei Cp).,
Molekulare Andocksimulationsexperimente zur Untersuchung molekularer Erkennungsmodi
Die Farbstoffbindung wurde durch flexible molekulare Andocksimulationen von AutoDock Vina27 bestimmt, die darauf ausgelegt waren, erschöpfend nach Bindungsstellen zu suchen und ihre freien Energien zu berechnen (Abb. 5 und Ergänzende Abb. S9). Kürzlich haben Wang et al.25 berichtete, dass AutoDock Vina im Vergleich zu anderen weit verbreiteten Docking-Programmen eine hohe Scoring-Leistung und eine mittlere Sampling-Leistung aufweist., Gemäß diesen Simulationen ist eine größere Anzahl von CBB G-250-Farbstoffmolekülen, die an freie Fe-Bindungsstellen in Apo-Tf gebunden sind, im Vergleich zu Holo-Tf (Abb. 5a) wurden beobachtet. Basierend auf diesen Autodock-Vina-Simulationen wurde das Verhältnis der Farbstoffbindungszahl NApo/NHolo auf 1,23 mit einer Bindungsenergie <-6,5 kcal/mol (entsprechend K~104,4 M-1) gefunden (Abb. 5b für die Farbstoffbindungszahl (Frequenzverteilung als Funktion der Bindungsenergie), die in guter Übereinstimmung mit unseren CZE-Ergebnissen ist, zuvor diskutiert (NApo/NHolo = 1.29)., Die quantitative Bindung wird mit der Zugabe des Farbstoffs in mM-Konzentrationen angenommen (über 95% der Bindungsstellen interagieren mit dem Farbstoff, wenn log K 4,4 oder größer ist), wie in diesen Experimenten.
Die Bindungszahl von Farbstoffmolekülen mit Holo-Tf wurde ebenfalls durch CZE-Experimente untersucht (Daten nicht gezeigt), wie aus der Abnahme des freien Farbstoffpeaks für eine 1 mM CBB G-250 Farbstoffprobe mit und ohne Zugabe von 10 µM Holo-Tf beurteilt wurde., Da die Bindungszahl auf >18 gemessen wurde, wurde angenommen, dass die Bindungszahl von NHolo in den MICS-BN-PAGE-Experimenten >20 war (mit 3,0 mM Farbstoffzusatz). Diese Bindungszahl von Farbstoffmolekülen (>20) aus CZE-Experimenten stimmt gut mit der Anzahl der gebundenen Farbstoffmoleküle (N = 21) aus molekularen Dockingsimulationen überein, die die vorhergesagte Affinität von -6,5 kcal/mol ergeben würden, und so sind unsere Ergebnisse selbstkonsistent.,
Aus diesen molekularen Docking-Simulationen und CZE – Experimenten geht hervor, dass CBB G-250 Farbstoff die verschiedenen chemischen Strukturen von Holo-und Apo-Metalloproteinen erkennt, um unterschiedliche µ-Werte zu ergeben. Detailliertere Beobachtungen der simulierten Bindungsmodi legen auch nahe, dass das CBB G-250-Molekül mit Aminosäureresten interagiert, die aufgrund der offeneren (entfalteten) Apo-Tf-Struktur im Vergleich zu der geschlosseneren (gefalteten) Holo-Tf-Struktur zugänglich sind, während der Farbstoff keine direkte Bindung mit Fe-bindenden Aminosäureresten zeigt (Asp392, Tyr429, Tyr517 und His 585)., Somit wird impliziert, dass der Farbstoff kleine Unterschiede zwischen den gefalteten und entfalteten chemischen Strukturen von Metalloproteinen erkennt, die durch die Bindung oder Dissoziation von Metallionen induziert werden. Solche kleinen Unterschiede können mit keinem anderen herkömmlichen Trennverfahren identifiziert werden.
Aminosäurereste, die das Farbstoffmolekül an jeder Farbstoffbindungsstelle in der Simulation berühren (z. B. Ergänzende Abb. S10) wurden nach ihrer dominanten Natur kategorisiert: hydrophobe, hydrophile oder elektrostatische Ladung (wie in ergänzender Tabelle S2 und Tabelle S3 zusammengefasst)., Den Ergebnissen zufolge zeigten die Populationen jeder Art von Aminosäure, die mit Farbstoffmolekülen interagierten, keinen Unterschied zwischen Holo – und Apo-Proteinformen (26-27% für hydrophobe, 37-40% für hydrophile, 33-35% für geladene Rückstände in jeder Form). Die Anzahl der Wasserstoffbrücken in Apo-Tf (33 insgesamt; 1,2 pro Bindungsstelle) war jedoch signifikant größer als in Holo-Tf (19 insgesamt; 0,9 pro Bindungsstelle). Bei der Fokussierung auf die acht Bindungsstellen in apo-Tf, die in Holo-Tf nicht vorhanden waren (ergänzende Tabelle S3), wurde festgestellt, dass die Anzahl der H-Bindungen pro Stelle 2.1 beträgt., Diese Ergebnisse deuten stark darauf hin, dass Änderungen der Wasserstoffbindungswechselwirkungen in erster Linie für die Differenzierung zwischen Holo – und Apo-Tf-Formen verantwortlich sind, während weitere Untersuchungen erforderlich wären, um den vollständigen Mechanismus zu verstehen.