Abstract
În plus față de anomalii motorii și de postură, copiii cu paralizie cerebrală (PC) de multe ori au dizabilități intelectuale. Ca terapie complementară și alternativă de Medicină Tradițională Chineză (TCM), masajul chinezesc Tuina, numit și Tuina în China, a fost aplicat pe scară largă în tratamentul clinic pentru CP în China de mult timp. Cu toate acestea, baza moleculară pentru acest lucru rămâne în mare parte necunoscută., Recent, hidroximetilarea ADN-ului sa dovedit a fi sensibilă la mediu și joacă roluri critice în unele tulburări neurologice, în timp ce cercetarea care se concentrează pe relația dintre terapia 5 hmC și Tuina pentru paralizia cerebrală este deficitară. În studiul nostru, am observat pentru prima dată că Tuina a îmbunătățit funcțiile de învățare și memorie ale puilor de șobolan hipoxic-ischemic (HI). Între timp, nivelul 5 hmC al cortexului lobului temporal în modelul de șobolan neonatal HI este scăzut semnificativ în comparație cu cel al șobolanilor din grupurile control și Tuina., Apoi, am folosit metoda hMeDIP-Seq pentru a explora dacă și cum hidroximetilarea ADN-ului este implicată în terapia Tuina pentru paralizia cerebrală. Adnotarea genomică a DhMRs din hipo-hidroximetilarea grupului HI la gene a evidențiat îmbogățirea în mai multe căi de semnalizare neurodezvoltare. Mai mult, am constatat că epuizarea a 5 modificări hmC în gene asociate cu dezvoltarea neuronală a fost însoțită de niveluri reduse de ARNm ale acestor gene., Luate împreună, rezultatele noastre indică faptul că Tuina poate regla expresia genelor legate de neurodezvoltare prin schimbarea stării hidroximetilării ADN, îmbunătățind astfel funcțiile de învățare și memorie ale paraliziei cerebrale.
1. Introducere
leziunea cerebrală care apare în perioada perinatală este o cauză majoră pentru dizabilitatea dobândită., Apariția leziunilor cerebrale la sugari este corelată cu mai mulți factori, cum ar fi hipoxia-ischemia, infecția, stresul oxidativ și răspunsul inflamator, printre care hipoxia-ischemia (IH) poate induce paralizia cerebrală (CP) prin declanșarea leziunilor cerebrale perinatale la prematur . CP este cea mai frecventă dizabilitate cronică neonatală, caracterizată prin deficiențe motorii și posturale și este adesea însoțită de deficite cognitive și de învățare . În studiile științifice de bază, modelul de șobolan neonatal HI a fost utilizat pe scară largă în explorarea rezultatelor comportamentale și a patogenezei paraliziei cerebrale ., În ciuda progresului mare în studiile CP, mecanismele moleculare ale modului în care hipoxia-ischemia contribuie la dezvoltarea și progresia CP rămân încă neclare.până în prezent, terapiile actuale pentru CP includ în principal intervenții chirurgicale ortopedice, medicamente antispastice și diverse tipuri de intervenții de învățare motorie, majoritatea funcționând doar pentru a trata complicațiile legate de CP și pot provoca efecte secundare., Cu toate acestea, medicina tradițională chineză (TCM), inclusiv Tuina, acupunctura și medicina pe bază de plante, singură sau combinată cu terapia convențională a medicinei occidentale, a fost utilizată pe scară largă ca tratament alternativ pentru CP în China . Tuina este o formă antică de masaj medical în medicina chineză, cu presiune aplicată cu degetul la punctele care sunt sensibilizate în mod putativ prin afectarea organelor . În special, Tuina, ca o intervenție mai sigură și mai eficientă, a prezentat efecte evidente asupra paraliziei cerebrale în practica clinică. Cu toate acestea, mecanismul exact al modului în care Tuina funcționează pe CP nu a fost încă elucidat.,dimpotrivă, modificările epigenetice patogene, sensibile la mediu, s-au dovedit deja a fi implicate în neurogeneză , învățare și memorie și plasticitate sinaptică . Printre diverse modificări epigenetice, metilare ADN-ului de pe cel de-al cincilea carbon de citozină (5-methylcytosine, 5 mC) este cel mai intens studiat modificare epigenetice care joacă roluri importante în structura cromatinei remodelarii, transcripțional suprimarea, și diferențiere celulară ., În plus, oxidarea 5 mC în 5-hydroxymethylcytosine (5 hmC) de zece-unsprezece translocație (TET) familie de gene este propus ca un nou mecanism pentru îndepărtarea de 5 mC , și 5 hmC a fost sugerat a fi critic în menținerea neuron structura și funcțiile datorită evidentă îmbogățire în creier . Între timp, modificarea hmC 5 este , de asemenea , identificată de multe studii care trebuie asociate cu tulburări neurologice , cum ar fi boala Alzheimer , sindromul Rett, sindromul tremor/ataxie fragil asociat x, boala Huntington și tulburările din spectrul autismului ., Aceste dovezi au oferit baza ipotezei că modificările hmC 5 pot juca roluri critice în boala sistemului nervos.,
Pentru a explora prezența implicarea Tuina terapie în alterarea 5 hmC în PC, am aplicat un stabilită chimice, etichetarea și afinitate metodă de purificare a cuplat cu high-throughput tehnologia de secvențiere pentru a descoperi posibile genome-wide 5 hmC modificări în BUNĂ șobolani înainte și după Tuina de tratament în scopul de a căuta o relație între 5 hmC și Tuina efecte terapeutice pe PC, oferind astfel dovezi pentru a susține cererea de Tuina tratament pentru paralizie cerebrala.
2. Materiale și metode
2.1., Toate experimentele au fost aprobate de Comitetul de etică pentru îngrijirea animalelor din Spitalul Jinshan afiliat Universității Fudan. Un model modificat de orez-Vannucci a fost folosit așa cum a fost descris anterior . Modelul HI neonatal a fost efectuat pe puii de șobolan Sprague-Dawley (Slac Laboratory Animal Company, Shanghai, China) în ziua 3 postnatală (P3) prin ligarea arterei carotide comune stângi sub anestezie izofluran 3%. Timpul de intervenție chirurgicală pentru fiecare șobolan a fost controlat în 10 minute., După recuperare timp de 1 oră, acești pui au fost plasați într-o cameră de hipoxie la 37°C și supuși mixerului de gaz compus din 8% O2 și 98% N2 timp de 3,5 ore. Animalele false au avut aceeași operație pentru a expune artera carotidă comună fără ligare și hipoxie. După operație, puii de șobolan au fost returnați în cușca lor de origine.
2. 2. Tratamentul cu Tuina
tratamentul cu Tuina a fost efectuat de un cercetător specializat cu certificat de medic profesionist. Din ziua P4 până la P31, puii de șobolan din grupul Tuina au acceptat intervenția Tuina care se efectuează de 120 de ori/min timp de 15 minute, o dată pe zi.,f Tuina este după cum urmează: în primul rând, rat a fost plasat pe palma de manipulator mâna stângă să se adapteze la mediu; în al doilea rând, manipulator folosit degetul mijlociu de la mana dreapta pentru a freca ușor rat de la gat la coada de trei ori pentru a vă relaxa mușchii săi; în al treilea rând, Tuina a fost efectuată de către succesive, frecare, frământare, și-un deget impinge de-a lungul coloanei vertebrale de șobolani de sus în jos și din afară înăuntru pe spinare și ambilateral ligamentelor precum și mușchii de-a lungul du meridianul vezicii urinare meridianul de șobolan, cu referire la legate de medicina tradițională Chineză (TCM) funcționează.,
2. 3. Reflexul de redresare
reflexul de redresare la șobolanii nou-născuți a fost evaluat de la P5 la P11, așa cum s-a descris anterior . În timpul acestui test, puii de șobolan au fost plasați într-o poziție în sus pe o suprafață plană curățată și a fost măsurat timpul pentru ca acești pui să atingă poziția predispusă cu toate cele patru labe.
2. 4. Gate Reflex
puii de șobolan au fost plasați în centrul unui carton rotund alb (13 cm în diametru), iar ziua în care s-au mutat din cerc cu ambele membre anterioare a fost înregistrată .
2, 5., Testul planului înclinat
Acest test a fost utilizat pentru a măsura rezistența membrelor prin înregistrarea unghiului maxim al pantei pe care puii de șobolan pot încă să reușească să prindă în ziua P21, așa cum se arată în Figura 1(b) . În timpul acestui test, șobolanii au fost plasați cu fața spre dreapta sau spre stânga, iar unghiul planului a fost crescut cu 5° la fiecare cinci secunde pentru a determina unghiul maxim al pantei la care șobolanul putea încă să țină .
2, 6. Testul de evitare a pasului în jos
Acest test a fost implementat pentru a măsura reținerea memoriei . Un șobolan a fost așezat ușor pe o platformă de izolare cilindrică (4.,5 cm în diametru și înălțime) într-o cameră de condiționare pentru a se adapta la mediul înconjurător timp de 3 min. Odată ce șobolanul coboară pe platformă, va fi electrificat imediat. În sesiunea de antrenament de 5 minute (P26), șobolanii au fost instruiți să sară înapoi pe platformă pentru a evita stimularea electrică. În sesiunile de testare (24 de ore după antrenament, adică P27), au fost înregistrate timpul de latență (timpul în care șobolanii să coboare de pe platformă pentru prima dată) și numărul de erori (frecvența șobolanilor care coboară de pe platformă).
2, 7., Testul Morris Water Maze (MWM)
pentru a evalua învățarea spațială și memoria, testul Morris water maze a fost efectuat timp de 5 zile, așa cum s-a descris anterior . Labirintul de apă (Shanghai Xinyuan Information Technology Company, Shanghai, China) a fost împărțit în patru cadrane, iar o platformă (5 cm în diametru) a fost plasată la 1 cm sub suprafața apei într-un cadran. În sesiunile de antrenament (P27–P30), toți șobolanii au fost instruiți de patru ori pe zi timp de patru zile consecutive și li sa permis să găsească platforma ascunsă în 60 de secunde., În cazul în care șobolanul nu a reușit să găsească platforma în termen de 60 s, acesta a fost ghidat ușor pe platformă și a permis să rămână pe ea timp de 30 s înainte de a fi trimis înapoi în cușcă. În ziua pentru studiul sondei spațiale (P31), platforma a fost îndepărtată și șobolanii au fost eliberați în apă cu care se confruntă peretele piscinei din aceeași poziție ca și în sesiunile de antrenament. Ulterior, au fost înregistrate pistele de mișcare și numărul de treceri ale locației platformei.
2, 8., Dot Blotting
după finalizarea testelor de mai sus, puii de șobolan au fost sacrificați pe P31, iar creierul lor a fost disecat pentru colectarea ADN-ului total al cortexului temporal stâng de către un mini kit ADN QIAAMP (Qiagen, Germania). 2.5 µL ADN genomic (100 ng/µL) a fost reperat pe membranele de nailon, urmată de coacere la 80°C timp de 30 min pentru a lega ADN-ul încrucișat . După blocarea cu 5% lapte degresat timp de 1 h la temperatura camerei, membrana a fost incubată cu anticorp policlonal 5 hmC (diluție 1 : 1000, motiv activ, Statele Unite, Cat. Nu., 39769) la 4°C peste noapte și anticorpul secundar conjugat cu peroxidază de hrean (HRP) a fost utilizat pentru a sonda a doua zi. Membrana dot blot a fost colorată cu 0,02% albastru de metilen (MB) pentru a asigura o încărcare egală.
2, 9. Hydroxymethylated ADN Immunoprecipitation (hMeDIP) Analiza și High-Throughput Secvențiere
ADN-ul Genomic a fost extras din cortexul temporal stâng a puilor de șobolan (de control: n = 3; HI: n = 3; Tuina: n = 3) și ulterior sonicate la 200-350 de perechi de baze (pb). Și fragmentele de ADN au fost reparate la sfârșit; adaptoarele a-tailed și Illumina au fost ligate., Apoi, ADN-ul legat de adaptor a fost denaturat și incubat cu 5 anticorpi hmC (Active Motif, Statele Unite, Cat. 39769) la 4°C peste noapte. Complexele anticorp-ADN au fost capturate de margele de proteine A/G. ADN-ul imunoprecipitat a fost purificat și a suferit o secvențiere de mare viteză efectuată pe sistemul Illumina HiSeq3000 (Illumina, Statele Unite) .
2. 10. Maparea datelor de secvențiere și bioinformatică
prelucrarea datelor de secvențiere a fost efectuată așa cum s-a descris anterior . Fișierele de secvență FASTQ după duplicările biologice au fost aliniate la genomul de referință UCSC rat (RGSC6 .0 / rn6)., Citirile unice, neduplicate, au fost utilizate pentru apelarea la vârf și adnotarea prin optimizarea hipergeometrică a îmbogățirii motivelor (HOMER) . Vârfurile de îmbogățire 5-hmC au fost determinate utilizând o analiză bazată pe model a software-ului ChIP-Seq (MACS). Și diferențiat hydroxymethylated regiuni (DhMRs) au fost identificate între toate perechile de 5-hmC-a îmbogățit probe de direct de a compara un eșantion cu o alta în fiecare direcție . Analizele de Ontologie genetică (GO) au fost efectuate folosind DAVID .
2, 11. Cantitativ RT-PCR
ARN Total a fost extras din cortexul lobului temporal stâng., Transcrierea inversă a ADNc a fost efectuată utilizând PrimeScript RT Master Mix Kit (Takara, Japonia). Reacțiile cantitative RT-PCR au fost efectuate pe sistemul PCR în timp real 7500 (Applied Biosystems, Statele Unite) folosind SYBR green (Takara, Japonia). β-actina a fost utilizată ca control intern, iar expresia relativă a genei țintă a fost determinată prin metoda 2−ΔΔCT., The sequences of primers used in the present experiment were listed as follows: Prkg2 primer (forward 5′-CCTCTGGATGTTCACCGCAAGAC-3′, reverse 5′-AGGTCATAGGTCCGGCTTGTGG-3′), Casd1 primer (forward 5′-GAGAGCAGACGGATGAATGGAAGG-3′, reverse 5′-AACAGATAAGCAGCCACCAGAACG-3′), Slc44a1 primer (forward 5′-ACACAGCCACAGCCATCAATAGC-3′, reverse 5′-CAGCCACTCGCAGAGCATTCTC-3′), and β-actin primer (forward 5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′, reverse 5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′).
2.12., Testul Western Blotting
cortexul lobului temporal stâng izolat a fost adăugat cu lizat de proteină rece ca gheața și centrifugat la 12000 r / min timp de 20 min la 4°C. probele de proteine au fost separate prin electroforeză folosind SDS-PAGE și transferate pe membranele PVDF (Millipore, Statele Unite). După blocarea cu 5% lapte degresat timp de 2 ore la temperatura camerei, membranele au fost incubate cu anticorpii primari la 4°C peste noapte și apoi incubate cu anticorpi IgG secundari conjugați cu HRP. Anticorpii primari utilizați aici au inclus anti-Tet1 (1: 1000, Abcam, UK, Cat. Nu., 191698), anti-Tet2 (1: 1000, Millipore, Statele Unite, Cat. # ABE364), anti-Slc44a1 (1 : 1000, Abcam, marea BRITANIE, Cat. 110767) și anti-β tubulină (1: 2000, cell Signaling Technology, Statele Unite, Cat. #2128). Membranele au fost apoi dezvoltate folosind detectarea ECL, iar semnalele au fost detectate cu sistemul de imagistică Chemiluminescent Tanon-5200 (Tanon, Shanghai, China). Nivelurile de proteine au fost analizate de Image J software (NIH, Bethesda, SUA) și normalizate la nivelul corespunzător de β-tubulină.
2, 13., Imunofluorescență microscopie confocală
puii de șobolan au fost sacrificați pe P31, iar inimile lor au fost perfuzate cu soluție salină 0.9% urmată de paraformaldehidă 4% (PFA). După perfuzie, creierul a fost disecat și fixat în 4% PFA peste noapte, urmat de a fi încorporat în parafină și realizat în secțiuni seriale de 5 µm. După recuperarea antigenului cu microunde în tampon de acid citric la 95°C, locurile nespecifice au fost blocate cu 5% albumină serică bovină (BSA) timp de 1 oră la temperatura camerei. Apoi, secțiunile creierului au fost incubate cu 5 anticorpi primari hmC (1: 1000, active Motif, Statele Unite, Cat. Nu., 39769) peste noapte la 4°C, urmată de incubarea cu anticorpul secundar (1 : 200, Viața Tehnologie, Statele Unite ale americii) 1 h la temperatura de 37°C. 4′,6-diamino-2-phenylindole (DAPI) a fost folosit pentru nucleară imunofluorescență colorare, și imunofluorescență imaginile au fost vizualizate și capturat pe un microscop confocal (Leica sp5, Germania).
2, 14. Analiza statistică
toate datele au fost exprimate ca medie ± eroare standard a mediei (SEM) și analizate prin utilizarea SPSS., Pentru determinarea diferențelor dintre cele 3 grupe a fost aplicată analiza unidirecțională a varianței (ANOVA), urmată de testul T-Test neparametric și testul Tukey cu diferență semnificativă. valoarea <0, 05 a fost considerată semnificativă statistic.
3. Rezultate
Tuina a îmbunătățit pierderea în greutate, slăbiciunea forței membrelor și tulburările reflexelor neurologice induse de HI.,greutatea corporală a puilor de șobolan a fost măsurată de la P4 la P28 și s-a constatat că, de la P22 la P28, greutatea corporală a șobolanilor din grupul Tuina (n = 11) a crescut semnificativ în comparație cu Grupul HI (N = 11; Figura 1(a)). Rezultatele testului planului înclinat au arătat că unghiurile maxime au fost mai mari în grupul Tuina decât cele din grupul HI (Figura 1(b)), ceea ce a indicat o îmbunătățire a slăbiciunii rezistenței membrelor în grupul Tuina., Rezultatele reflexelor sistemului nervos au fost următoarele: în testul reflexelor de mers, puii de șobolan din grupul HI au început să se îndepărteze de cerc cu ambele membre anterioare semnificativ mai târziu decât cei din grupurile control și Tuina (Figura 1(c)). În testul reflex de redresare, șobolanii din grupul Tuina au avut mai puțin timp să se îndrepte decât cei din grupul HI de la P7 la P11 (Figura 1(d)).Tuina a promovat funcțiile de învățare și memorie ale puilor de șobolan hipoxic-ischemic.,testul Morris water maze și testul step-down au fost efectuate pentru a evalua funcțiile de învățare și memorie ale șobolanilor. După cum se arată în Figura 2(a), pistele de mișcare din ziua încercării sondei a testului MWM arată că numărul de treceri ale locației platformei din grupul HI a fost semnificativ mai mic decât cel al grupului de control și al grupului Tuina [Figura 2 (b)]. În testul de reducere, șobolanii HI au prezentat un timp de latență semnificativ mai scurt și mai multe erori în comparație cu șobolanii control și Tuina (figurile 2(c) și 2(d)).Tuina a crescut nivelurile 5 hmC și Tet2 în cortexul temporal cerebral al șobolanilor HI.,pentru a examina dacă nivelul de 5 hmC a fost afectat în timpul dezvoltării CP, am efectuat teste dot blot și am observat că nivelul 5 hmC al șobolanilor HI a scăzut semnificativ în comparație cu cel al controlului, în timp ce acest nivel a fost parțial crescut după Tuina (; Figura 3(a)). Între timp, colorarea cu imunofluorescență a demonstrat îmbinarea colorării 5 hmC și DAPI și HI a dus la scăderea genomică 5 hmC în cortexul temporal stâng, în timp ce tratamentul cu Tuina a restabilit nivelul 5 hmC într-o anumită măsură (Figura 3(b)), care a fost în concordanță cu rezultatele dot blotting., Mai mult, așa cum se arată în figurile 3(c) și 3(d), grupul IH a prezentat scăderea expresiei Tet1 și Tet2 în comparație cu grupul de control, în timp ce numai Tet2 a fost crescut după terapia cu Tuina.
3. 1. Genome-Wide 5 hmc Modificarea și Distribuție
Pentru a investiga locația exactă și distribuție a genomului 5 hmc, hydroxymethylated ADN immunoprecipitation (hMeDIP), urmat de next-generation sequencing (hMeDIP-seq) a fost efectuată., Șobolanii, respectiv, din grupurile Control (N = 3), HI (n = 3) și Tuina (n = 3) au fost sacrificați pe P31, iar ADN-ul genomic al cortexului lobului temporal stâng a fost extras pentru hMeDIP-seq. Modelul genomului la nivel de nivel 5 hmC a fost evaluat prin numărarea citirilor 5 hmC mapate în fiecare coș 10 kb din probele grupurilor control, Tuina și HI și apoi normalizate la acoperirea totală a secvențierii . După cum se arată în figurile 4(a)-4(c), distribuția 5 hmC la nivelul genomului în cele trei grupuri a fost diferită, iar apoi am explorat în continuare regiunile genetice specifice în care există aceste diferențe., Figura 4(d) arată suprapunerea caracteristici ale normalizat densitate de 5 hmC citește cu cunoscute genomice caracteristici pe gene organisme și CGI (insulele CpG) potrivit UCSC masă pentru RGSC6.0/rn6. Mai mult, așa cum se arată în Figura 4(e), au fost studiate și distribuțiile a 5 hmC la corpurile genetice și 1 kb în sus și în aval de corpurile genetice., Se poate observa din Figurile 4(d) și 4(e) 5 hmC nivel de HI grup diferă de cele ale grupului de control și Tuina grup la sfârșitul 5′ genomic corpului, mai ales la site-uri de ±500 bp a transcripțională a începe site-uri (TSS) și CGI la 500 bp de TSS.
3. 2. Identificarea și Adnotare de Diferențiat Hydroxymethylated Regiuni (DhMRs)
Pentru a indica specifice loci care prezintă modificat de 5 hmC profile, am procedat la identificarea și caracterizarea specifice DhMRs de toate autozomi și cromozomi sexuali peste genomului., Interesant, a existat o mare diferență în distribuția hiper-DhMRs și hipo-DhMRs pe cromozomul X (figurile 5(a)-5(c)). Pentru a explora în continuare semnificația biologică a găsit DhMRs, genele asociate cu aceste DhMRs au fost extrase pentru gene ontology (GO) de îmbogățire analiză., Așa cum se arată în Figurile 5(d) și 5(e), DU-te de îmbogățire analiza a indicat că aceste hipo-DhMRs în HI grup s-au dovedit extrem de îmbogățit pe căi funcționale legate de neurodezvoltării și funcții neuronale, inclusiv de dezvoltare, de creștere a celulelor, neuron de proiecție extensie, regulamentul pozitiv de dezvoltare, de creștere, de dezvoltare, de creștere implicate în morfogeneza și celule gliale diferențiere.,
Bazat pe o analiză cuprinzătoare a hydroxymethylation diferențial gene liste de cele trei grupuri, am selectat șase hipo-DhMRs asociate gene de la HI grup care au fost toate asociate cu funcțiile sistemului nervos de a investiga relația între 5 hmC modificări și transcriere niveluri de aceste gene., Și ceea ce este de așteptat, s-a constatat că, în conformitate cu reducerea de 5 hmC modificare în Casd1, Prkg2, și Slc44a1, corespunzătoare arnm niveluri au fost, de asemenea, a scăzut semnificativ în HI grup, în comparație cu cei în control și Tuina grupuri (Figura 5(f)).
4. Discuție
cu siguranță generală și eficacitate reputată, medicina tradițională chineză (TCM) este ușor acceptată de populația generală din întreaga lume. TCM a fost aplicat pe scară largă în diferite boli pediatrice, cum ar fi sarcomul Ewing , astmul , boala Graves și tulburările alergice pediatrice ., Între timp, există, de asemenea, studii care indică faptul că Terapiile TCM, inclusiv Tuina, medicamentele pe bază de plante și acupunctura sunt bine tolerate și au efecte terapeutice pozitive asupra paraliziei cerebrale . Datorită rezultatelor clinice promițătoare și a mai puține efecte secundare, masajul chinezesc Tuina a atras un interes tot mai mare în ceea ce privește tratamentul pentru CP.ca o nouă modificare epigenetică, 5 hmC nu numai că servește ca intermediar al proceselor de demetilare a ADN-ului, dar acționează și ca un marker epigenetic stabil în timpul dezvoltării diferitelor boli ., 5 hmC este de aproximativ zece ori mai îmbogățit în neuroni decât în alte celule, iar reglarea sa dinamică este critică în neurodezvoltarea postnatală . Mai mult, modificarea nivelului global 5 hmC a fost considerată strâns legată de multe tulburări neurodegenerative și boli neurodevelopmentale .cu toate acestea, din cunoștințele noastre, puține studii s-au concentrat asupra legăturii dintre hidroximetilarea ADN-ului și paralizia cerebrală, care a devenit inspirația pentru cercetarea noastră., În studiul nostru, rezultatele dot blotting și imunofluorescență a arătat că nivelul global 5 hmC în cortexul lobului temporal cerebral a scăzut semnificativ după leziuni HI, ceea ce este în concordanță cu nivelul redus 5 hmC în rinichiul șoarece după ischemie-reperfuzie . Cu toate acestea, după tratamentul cu Tuina, nivelul 5 hmC din grupul Tuina a fost mai mare decât cel din grupul HI., Mai mult, se știe că 5 hmC este produs prin oxidarea a 5 mC de proteinele Tet, pe baza cărora am detectat nivelurile de proteine Tet1 și Tet2 și am constatat că ambele niveluri au scăzut semnificativ după leziunea HI, în timp ce numai proteina Tet2 a fost crescută după tratamentul cu Tuina. În total, aceste constatări implică faptul că expresia redusă Tet1 și Tet2 poate contribui la scăderea 5 hmC după rănirea HI, iar Tuina poate crește nivelul 5 hmC prin îmbunătățirea expresiei Tet2.,dimpotrivă, metilarea CGI în promotori a fost găsită critică în tăcerea genelor și 5 hmC poate juca un rol în expresia genelor mediată de demetilarea ADN-ului . În studiul nostru, Grupul HI a prezentat o îmbogățire scăzută a 5 hmC la nivelul genomului în CGI în cadrul a 500 bp de TSS comparativ cu grupurile control și Tuina, în timp ce Tuina a crescut distribuția la nivelul genomului de 5 hmC., Între timp, în conformitate cu constatările anterioare că îmbogățirea 5 hmC în gena organism poate are o corelație puternică cu transcrierea crescut în cauză gene din neuronii noștri RT-PCR rezultatele au arătat că epuizarea 5 hmC modificare în Prkg2, Casd1, și Slc44a1 gena a fost însoțită de reducerea arnm niveluri de aceste gene în HI grup., Pe baza tuturor acestor constatări menționate mai sus, s-a indicat că modificarea 5 hmC poate juca un rol critic în patogeneza CP prin reglarea transcripției și expresiei genelor legate de funcțiile neuronale, iar Tuina poate produce efecte terapeutice asupra CP prin modularea 5 hmC.
mai interesant, sa constatat că CP și tulburările de dezvoltare asociate sunt mai frecvente observate la pacienții de sex masculin și modelul de șoarece neonatal feminin de leziuni cerebrale HI , De asemenea, a afișat o apariție mai scăzută a CP, motivul pentru care este încă incert., Pentru a evita perturbarea acestor posibile efecte protectoare specifice genului, au fost selectați doar puii de șobolan masculi pentru studiul nostru. Remarcabil, în genomului circular hartă (Figura 5(a)), mari diferențe în distribuția de hiper-DhMRs și hipo-DhMRs pe cromozomul X a fost observată de comparație între cele două grupuri în studiul nostru, care confirmă corelația între sex și apariția de paralizie cerebrala., În special, din cauza limitărilor de laboratorul nostru, nu am putea face IgG control sau de a genera intrare biblioteci, și DhMRs au fost identificate de către compară direct una la alta, mai degrabă decât față de intrare, care ne va intenționează să îmbunătățească în viitorul nostru studiile pentru a face cercetări mai precise.mai mult, analizele GO ale genelor asociate hipo-DhMRs din grupul HI au arătat că aceste gene sunt foarte îmbogățite în mai multe căi de semnalizare legate de neurodezvoltare și funcții neuronale., În experimentul nostru, întârzierea creșterii și tulburările neurodezvoltării au apărut în grupul HI sub formă de pierdere în greutate, slăbiciune a forței membrelor și mai multe tulburări reflexe neuronale care au fost îmbunătățite printr-un tratament cu Tuina într-o oarecare măsură. Mai mult, din rezultatele testului Morris water maze și testul de evitare a pasului în jos, Tuina a îmbunătățit semnificativ funcțiile de învățare și memorie ale șobolanilor hipoxic-ischemici., Aceste rezultate indică o corelație între modificarea în 5-hydroxymethylcytosine loci și dezvoltarea neuronală și furtherly sugerează că Tuina terapie poate influența evoluției cerebrale și cerebrale funcțiilor cognitive prin modularea ADN hydroxymethylation.în studiul de față, am furnizat hărți hmC la nivelul genomului 5 ale grupurilor control, HI și Tuina și am evidențiat modificarea stării de hidroximetilare a ADN-ului și modificarea dinamică a hmC 5 după tratamentul cu Tuina, ceea ce poate arunca o lumină asupra posibilului mecanism terapeutic al Tuina pentru CP.,
disponibilitatea datelor
datele utilizate pentru a susține rezultatele acestui studiu sunt disponibile de la autorul corespondent, la cerere.
conflicte de interese
autorii declară că nu există conflicte de interese.
contribuțiile autorilor
Yunpeng Zhang și Chao Gao au contribuit în mod egal la această lucrare.,
Aprecieri
Această lucrare a fost susținută de către National Science Foundation Naturale din China (81774444), Provincia Henan Știință și Tehnologie de Cercetare Proiect (182102310403), China-Canada Cooperare Proiectului de Cercetare Clinică, Provincia Henan Program de Studiu în Străinătate (201721), și Provincia Henan Medicale Știință și Tehnologie de Cercetare Proiect (Provinciale și Ministerul Construcțiilor Proiect) (201701034).