Abstrakt
ud over at abnormiteter af motor og kropsholdning, børn med cerebral parese (CP) har ofte intellektuelle handicap. Som en komplementær og alternativ traditionel kinesisk medicin (TCM) terapi, Kinesisk Tuina massage, også kaldet Tuina i Kina, har været meget anvendt i klinisk behandling for CP i Kina i lang tid. Imidlertid er det molekylære grundlag for dette stadig stort set ukendt., For nylig har DNA-hydro .ymethylering vist sig at være følsom over for miljøet og spiller kritiske roller i nogle neurologiske lidelser, mens forskningen med fokus på forholdet mellem 5 hmC og Tuina-terapi til cerebral parese er mangelfuld. I vores undersøgelse observerede vi først, at Tuina forbedrede indlæring og hukommelsesfunktioner af hypo .isk-iskæmiske (HI) rotteunger. I mellemtiden reduceres 5 hmC-niveau af den temporale lobe Corte.i HI neonatal rotte-modellen markant sammenlignet med niveauet for rotterne i kontrol-og Tuina-grupperne., Derefter brugte vi hmedip-se. – metoden til at undersøge, om og hvordan DNA-hydro .ymethylering er involveret i Tuina-terapi til cerebral parese. Genomisk annotation af Dhmr ‘ er fra HI-gruppens hypo-hydro .ymethylering til gener afslørede berigelse i flere neuroudviklingssignalveje. Desuden fandt vi, at udtømningen af 5 hmC-modifikationer i gener forbundet med neuronal udvikling blev ledsaget af reducerede mRNA-niveauer af disse gener., Samlet set viser vores resultater, at Tuina kan regulere ekspressionen af neuroudviklingsrelaterede gener ved at ændre status for DNA-hydro .ymethylering og derved forbedre indlæring og hukommelsesfunktioner af cerebral parese.
1. Introduktion
Cerebral skade, der forekommer i perinatalperioden, er en væsentlig årsag til erhvervet handicap., Forekomsten af cerebral skade i spædbørn er korreleret med flere faktorer, såsom hypoksi-iskæmi, infektion, oxidativ stress, og inflammatorisk respons blandt hvilke hypoksi-iskæmi (HI) kan medføre cerebral parese (CP) ved at udløse perinatal cerebrale læsioner i preterm . CP er den hyppigste neonatal kronisk handicap, kendetegnet ved motoriske og posturale svækkelser, og er ofte ledsaget af kognitive og læring underskud . I grundvidenskabelige studier har HI neonatal rat-modellen været meget anvendt til at udforske adfærdsmæssige resultater og patogenese af cerebral parese ., På trods af den store fremgang i CP undersøgelser, de molekylære mekanismer for, hvordan hypoksi-iskæmi bidrager til CP udvikling og progression stadig blive uklar.
til denne dag inkluderer de nuværende terapier for CP hovedsageligt ortopædisk kirurgi, antispasticitetsmedicin og forskellige former for motorindlæringsinterventioner, hvoraf de fleste kun arbejder for at behandle komplikationerne relateret til CP og kan medføre bivirkninger., Traditionel kinesisk medicin (TCM), herunder Tuina, akupunktur og urtemedicin, alene eller kombineret med konventionel terapi af vestlig medicin, er imidlertid blevet anvendt i vid udstrækning som en alternativ behandling af CP i Kina . Tuina er en gammel form for medicinsk massage i kinesisk medicin, med anvendt fingertryk på akupunkter, der er putativt sensibiliseret ved organsvigt . Især har Tuina som en sikrere og mere effektiv indgriben vist åbenlyse effekter på cerebral parese i klinisk praksis. Den nøjagtige mekanisme for, hvordan Tuina fungerer på CP, er dog endnu ikke blevet belyst.,tværtimod har patogenisk, miljøfølsomme epigenetiske modifikationer allerede vist sig at være involveret i neurogenese , læring og hukommelse og synaptisk plasticitet . Blandt de forskellige epigenetiske modifikationer er DNA-metylering på femte carbon cytosin (5-methylcytosine, 5 mC) er den mest grundigt undersøgte epigenetisk modifikation, som spiller vigtige roller i kromatin struktur remolding, transkriptionel undertrykkelse, og cellulær differentiering ., Desuden oxidation af 5 mC i 5-hydroxymethylcytosine (5 hmC) ved ti-elleve translokation (TET) gen familie er foreslået som en ny mekanisme for fjernelse af 5 mC , og 5 hm er blevet foreslået at være kritisk i vedligeholdelse af neuron struktur og funktioner, der på grund af sin åbenlyse berigelse i hjernen . I mellemtiden identificeres 5 hmC-ændringer også af mange undersøgelser for at være forbundet med neurologiske lidelser, såsom Al .heimers sygdom , Rett-syndrom , skrøbeligt associated-associeret tremor/ataksi-syndrom , Huntingtons Sygdom og autismespektrumforstyrrelser ., Disse beviser gav grundlaget for hypotesen om, at 5 hmC-ændringer kan spille kritiske roller i nervesystemets sygdom.,
for At udforske tilstedeværelse af inddragelse af Tuina behandling i ændringen af 5 hm i CP, hvor vi anvendt en etableret kemisk mærkning og affinitetsoprensning metode kombineret med high-throughput-sekventering teknologi til at afsløre mulige genome-wide 5 hm ændringer i HI rotter før og efter Tuina behandling for at søge forholdet mellem 5 hm og Tuina terapeutiske virkninger på CP, og derved give bevis til støtte for anvendelsen af Tuina behandling af cerebral parese.
2. Materialer og metoder
2.1., Dyremodel
alle eksperimenter blev godkendt af Etikudvalget for dyrepleje af Jinshan Hospital tilknyttet Fudan University. En modificeret ris-Vannucci-model blev anvendt som tidligere beskrevet . Neonatal HI model blev udført på Sprague-Dawley mandlige rotte unger (Slac forsøgsdyr Selskab, Shanghai, Kina) på fødselsdepression dag 3 (P3) via ligering af venstre halspulsåren under 3% isofluran anæstesi. Operationstiden for hver rotte blev kontrolleret inden for 10 minutter., Efter genopretning i 1 time blev disse unger anbragt i et hypo .ikammer ved 37.C og underkastet gasblanderen sammensat af 8% O2 og 98% N2 i 3, 5 timer. Sham dyr havde den samme operation for at udsætte den fælles halspulsårer uden ligering og hypo .i. Efter operationen blev rotteungerne vendt tilbage til deres hjemmebur.
2.2. Tuina behandling
Tuina behandling blev udført af en specialiseret forsker med professionel læge certifikat. Fra dagen for P4 til P31 accepterede rotteunger i Tuina-gruppen Tuina-intervention, der udføres 120 gange/min i 15 minutter, en gang dagligt.,f Tuina er som følger: for det første rotte, der var placeret på palm af manipulator ‘ s venstre hånd til at tilpasse sig til miljøet; for det andet, den manipulator anvendes den midterste finger på højre hånd til forsigtigt at gnide rotte fra nakke til hale tre gange for at slappe af sine muskler; for det tredje, Tuina blev båret ud af efterfølgende at gnide, æltning, og én-finger presser langs ryggen af rotter fra top til bund og fra vrangen ud på dorsum og ambilateral ledbånd samt muskler langs du meridian og blære meridian rat med henvisning til relaterede traditionel Kinesisk medicin (TCM) virker.,
2, 3. Oprettende refleks
oprettende refleks af nyfødte rotter blev vurderet fra P5 til P11, som beskrevet før . Under denne test blev rotteungerne anbragt i en liggende position på en renset flad overflade, og tiden for disse hvalpe til at nå den udsatte position med alle fire poter blev målt.
2.4. Gangrefleks
Rotteunger blev anbragt i midten af en hvid afrundet pap (13 cm i diameter), og dagen da de flyttede ud af cirklen med begge forben blev optaget .
2, 5., Skrå plan Test
denne test blev brugt til at måle lemmer styrke ved at registrere den maksimale vinkel af hældningen, som rotteungerne stadig kan klare at greb på dagen for P21, som vist i Figur 1(b) . Under denne test blev rotterne anbragt mod højre eller venstre, og vinklen på flyet blev forøget med 5 every hvert femte sekund for at bestemme den maksimale vinkel på den hældning, som rotten stadig kunne holde .
2, 6. Step-do .n Undgåelsestest
denne test blev implementeret for at måle opbevaring af hukommelse . En rotte blev forsigtigt anbragt på en cylindrisk isoleringsplatform (4.,5 cm i diameter og højde)i et konditioneringskammer for at tilpasse sig det omgivende miljø i 3 minutter. Når rotten træder ned ad platformen, bliver den elektrificeret med det samme. I den 5-minutters træningssession (p26) blev rotterne trænet til at hoppe tilbage på platformen for at undgå den elektriske stimulering. I testsessionerne (24 timer efter træning, dvs. P27) blev latenstiden (tiden for rotterne at træde ned fra platformen for første gang) og antallet af fejl (hyppigheden af rotterne, der træder ned fra platformen) registreret.
2, 7., Morris Water Maze (MWM) Test
for at vurdere, rumlig indlæring og hukommelse, Morris water maze test blev udført for 5 dage, som tidligere beskrevet . Vandet labyrint (Shanghai Xinyuan Information Technology Company, Shanghai, Kina) var opdelt i fire kvadranter, og en platform (5 cm i diameter) blev placeret 1 cm under vandoverfladen i en kvadrant. I træningssessionerne (P27–P30) blev alle rotter trænet fire gange om dagen i fire på hinanden følgende dage, og de fik lov til at finde den skjulte platform inden for 60 s., Hvis rotten ikke kunne finde platformen inden for 60 s, blev den forsigtigt ført til platformen og fik lov til at blive på den i 30 s, før den blev sendt tilbage til buret. På dagen for spatial probe trial (P31) blev platformen fjernet, og rotterne blev frigivet i vandet mod poolvæggen fra samme position som i træningssessionerne. Derefter blev bevægelsessporene og antallet af platformsplaceringskrydsninger registreret.
2.8., Dot Blotting
Efter afslutning af ovennævnte prøver, rotte unger blev ofret på P31 og deres hjerner blev dissekeret for at indsamle de samlede DNA venstre temporal cortex af en QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Tyskland). 2, 5 µL genomisk DNA (100 ng/µL) blev set på nylonmembraner efterfulgt af bagning ved 80 .C i 30 minutter til tværbundet DNA. Efter blokering med 5% fedtfri mælk i 1 time ved stuetemperatur blev membranen inkuberet med polyklonalt 5 hmC-antistof (1 : 1000 fortynding, aktivt motiv, USA, kat. Ingen., 39769) ved 4 C C natten over, og peberrodspero .idase (HRP)-konjugeret sekundært antistof blev brugt til at sonde den næste dag. Dot blot-membranen blev farvet med 0,02% methylenblåt (MB) for at sikre lige belastning.
2, 9. Hydroxymethylated DNA Immunoprecipitation (hMeDIP) Analyse og High-Throughput-Sekventering
Genomisk DNA blev ekstraheret fra venstre temporal cortex af rotte unger (kontrol: n = 3; HEJ: n = 3; Tuina: n = 3) og sonicated til 200-350 basepar (bp). Og DNA-fragmenterne blev repareret; a-tailed og Illumina adaptere blev ligeret., Derefter blev adapter-ligeret DNA denatureret og inkuberet med 5 HMC-antistof (aktivt motiv, USA, kat. 39769) ved 4 C C natten over. Antistof-DNA-komplekser blev fanget af protein A / G perler. Det immunprecipiterede DNA blev renset og gennemgik høj gennemløbssekvensering udført på Illumina Hise .3000-systemet (Illumina, USA) .
2.10. Kortlægning af sekventeringsdata og bioinformatik
behandling af sekventeringsdata blev udført som beskrevet tidligere . Fast.sekvens filer efter biologiske duplikationer blev justeret til UCSC rotte reference genom (RGSC6 .0/rn6)., Unikke, nonduplicate læsninger blev brugt til topopkald og annotation ved hypergeometrisk optimering af motif berigelse (HOMER) . 5 – HMC berigelsestoppe blev bestemt ved hjælp af en modelbaseret analyse af ChIP-se. (MACS) soft .are. Og differentielt hydro .ymethylerede regioner (Dhmr ‘ er) blev identificeret blandt alle par af 5-hmC-berigede prøver ved direkte at sammenligne en prøve med en anden i alle retninger . Gene ontology (GO) analyser blev udført ved hjælp af DAVID .
2, 11. Kvantitativ RT-PCR
Total RNA blev ekstraheret fra den venstre temporale lobe Corte.., Omvendt transkription af cDNA blev udført ved hjælp af PrimeScript RT Master mi.Kit (Takara, Japan). Kvantitative RT-PCR-reaktioner blev udført på 7500 realtids-PCR-system (Applied Biosystems, USA) ved anvendelse af SYBR green (Takara, Japan). β-actin blev anvendt som en intern kontrol, og relativ ekspression af målgen blev bestemt ved 2-methodcct-metoden., The sequences of primers used in the present experiment were listed as follows: Prkg2 primer (forward 5′-CCTCTGGATGTTCACCGCAAGAC-3′, reverse 5′-AGGTCATAGGTCCGGCTTGTGG-3′), Casd1 primer (forward 5′-GAGAGCAGACGGATGAATGGAAGG-3′, reverse 5′-AACAGATAAGCAGCCACCAGAACG-3′), Slc44a1 primer (forward 5′-ACACAGCCACAGCCATCAATAGC-3′, reverse 5′-CAGCCACTCGCAGAGCATTCTC-3′), and β-actin primer (forward 5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′, reverse 5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′).
2.12., Western Blotting-Analysen
Den isolerede venstre temporal lobe cortex blev tilføjet med is-kolde protein prøve og centrifugeres ved 12000 r/min 20 min ved 4°C. Protein prøver blev adskilles ved elektroforese ved hjælp af SDS-PAGE og overført til PVDF membraner (Milipore, Usa). Efter blokering med 5% nonfat mælk i 2 timer ved stuetemperatur, membraner blev inkuberet med den primære antistoffer ved 4°C natten over og derefter inkuberes med HRP-konjugeret sekundære IgG-antistoffer. De primære antistoffer, der blev brugt her, omfattede anti-Tet1 (1 : 1000, Abcam, UK, Cat. Ingen., 191698), anti-Tet2 (1: 1000, Millipore, USA, kat. # ABE364), anti-Slc44a1 (1 : 1000, Abcam, UK, Kat. No. 110767), og anti-tub tubulin (1: 2000, celle signalering teknologi, USA, Cat. #2128). Membranerne blev derefter udviklet ved hjælp af ECL-detektion, og signalerne blev detekteret med Tanon-5200 kemiluminescerende billeddannelsessystem (Tanon, Shanghai, Kina). Proteinniveauerne blev analyseret ved hjælp af Image J-soft .are (NIH, Bethesda, USA) og normaliseret til det tilsvarende β-tubulin-niveau.
2, 13., Immunofluorescens Konfokal Mikroskopi
Rotte unger blev ofret på P31, og deres hjerter var perfused med 0,9% saltvand efterfulgt af 4% paraformaldehyd (PFA). Efter perfusion blev hjernerne dissekeret og fikseret i 4% PFA natten over efterfulgt af indlejret i paraffin og lavet i 5 µm serielle sektioner. Efter mikrobølgeantigen hentning i citronsyrebuffer ved 95.C blev uspecifikke steder blokeret med 5% bovint serumalbumin (BSA) i 1 time ved stuetemperatur. Dernæst blev hjernesektionerne inkuberet med 5 HMC primært antistof (1 : 1000, aktivt motiv, USA, kat. Ingen., 39769) natten over ved 4°C, efterfulgt af inkubation med det sekundære antistof (1 : 200, Liv Technology, Usa) i 1 time ved 37°C. 4′,6-diamino-2-phenylindole (DAPI) blev anvendt til nuklear immunofluorescens farvning, og immunofluorescens billeder blev visualiseret og fanget på en konfokal mikroskop (Leica sp5, Tyskland).
2, 14. Statistisk analyse
alle data blev udtrykt som middel error standardfejl for middelværdien (SEM) og analyseret ved hjælp af SPSS., Envejsanalyse af varians (ANOVA) blev anvendt til at bestemme forskellene mellem de 3 grupper, efterfulgt af nonparametric t-test og Tukey ærligt signifikant forskel test. værdi <0, 05 blev betragtet som statistisk signifikant.
3. Resultater
Tuina forbedret vægttab, svaghed i lemstyrke og lidelser i neurologiske reflekser induceret af HI.,
kropsvægt af rotteunger blev målt fra P4 til P28, og det blev fundet, at fra P22 til P28 steg kropsvægten af rotterne i Tuina-gruppen (n = 11) signifikant sammenlignet med HI-gruppen (n = 11; Figur 1(a)). Resultaterne af den skrå plane test viste, at de maksimale vinkler var højere i Tuina-gruppen end dem i HI-gruppen (Figur 1(B)), hvilket indikerede forbedring af svagheden i lemstyrken i Tuina-gruppen., Resultaterne af nervesystemet reflekser var som følgende: i den gangart reflekser test, rotte unger i HI-gruppen begyndte at bevæge sig væk fra cirklen med begge forbens betydeligt senere end dem, der er i kontrol, og Tuina grupper (Figur 1(c)). I den oprettende reflekstest tog rotterne i Tuina-gruppen kortere tid til at rette sig selv end dem i HI-gruppen fra P7 til P11 (Figur 1(d)).
Tuina fremmet læring og hukommelse funktioner af hypo .isk-iskæmiske rotte hvalpe.,
Morris vand labyrint test og step-do .n test blev udført for at evaluere de læring og hukommelse funktioner af rotterne. Som vist i Figur 2, litra a), bevægelse spor på sonden retssag dag af MWM test viser, at antallet af platform placering krydsninger af HI-gruppen var signifikant mindre end for kontrolgruppen, og Tuina gruppe (Figur 2(b)). I step-do .n-testen viste HI-rotterne signifikant kortere latenstid og flere fejl sammenlignet med kontrol-og Tuina-rotter (figur 2(C) og 2(d)).
Tuina øgede 5 hmC-og Tet2-niveauer i den cerebrale temporale Corte.hos HI-rotter.,
for at undersøge, om niveauet af 5 hmC blev påvirket under CP-udvikling, udførte vi dot blot-test og observerede, at 5 hmC-niveauet af HI-rotter faldt markant sammenlignet med kontrolniveauet, mens dette niveau delvist blev forøget efter Tuina (; figur 3(a)). I mellemtiden, immunofluorescens farvning vist, at en sammenlægning af 5 hm og DAPI farvning og HI-førte til fald i genomisk 5 hm i venstre temporal cortex, mens Tuina behandling restaureret 5 hm-niveau til en vis grad (Figur 3(b)), hvilket var i overensstemmelse med resultaterne af dot blotting., Som vist i figur 3 (C) og 3(D) viste HI-gruppen desuden nedsat Tet1-og Tet2-ekspression sammenlignet med kontrolgruppen, hvorimod kun Tet2 blev forøget efter Tuina-behandling.
3, 1. Genome-Wide 5 hm Ændring og Distribution
for At undersøge den nøjagtige placering og fordeling af genom-dækkende 5 hm, hydroxymethylated DNA immunoprecipitation (hMeDIP) efterfulgt af næste-generations sekventering (hMeDIP-seq) blev udført., De rotter, henholdsvis fra Kontrol (n = 3), HI (n = 3), og Tuina (n = 3) grupper, der blev ofret på P31, og genomisk DNA af venstre temporal lobe cortex blev udtrukket til hMeDIP-ff. Genom-bredt mønster af 5 HMC niveau blev evalueret ved at tælle 5 hmC-kortlagt læser i hver 10 kb bin fra prøverne af kontrol -, Tuina-og HI-grupperne og derefter normaliseret til den samlede sekventeringsdækning . Som vist i figur 4(a)-4 (C), fordelingen af genom-dækkende 5 hmC læser i de tre grupper var forskellige, og derefter vi yderligere udforsket de specifikke gen regioner, hvor disse forskelle eksisterer., Figur 4 (d) viser de overlappende træk ved normaliseret densitet på 5 hmC læser med de kendte genomiske træk på definerede genlegemer og CGI (CpG-øer) i henhold til UCSC-tabellen for RGSC6.0/rn6. Endvidere, som vist i figur 4(E), blev fordelingerne af 5 hmC ved genlegemer og 1 kb op – og nedstrøms for genlegemer også undersøgt., Det kan observeres fra figurerne 4 (D) og 4(E), AT 5 hmC-niveauet for HI-gruppen adskiller sig fra kontrolgruppen og Tuina-gruppen ved 5′ – enden af det genomiske legeme, især på stederne ±500 bp for de transkriptionelle startsteder (TSS) og CGI inden for 500 bp for TSS.
3, 2. Identifikation og Kommentering af Differentielt Hydroxymethylated Regioner (DhMRs)
for At lokalisere de specifikke loci udstiller ændret 5 hm profiler, fortsatte vi med at identificere og karakterisere specifikke DhMRs af alle piger og sex kromosomer over hele genomet., Interessant nok var der stor forskel i fordelingen af hyper-Dhmr ‘er og hypo-dhmr’ er på Chromos-kromosomet (figur 5(a)-5(c)). For yderligere at undersøge den biologiske betydning af de fundne Dhmr ‘er blev generne forbundet med disse Dhmr’ er ekstraheret til Gen ontologi (GO) berigelsesanalyse., Som vist i figur 5, litra d), og artikel 5, litra e), GÅ berigelse analyse viste, at disse hypo-DhMRs i HI gruppe blev fundet højt beriget på den funktionelle veje, der er relateret til åndedrætssygdomme og neuronal funktioner, herunder udviklingsmæssige celle vækst, neuron projektion udvidelse, positiv regulering af udviklingsmæssige vækst, udviklingsmæssige vækst, der er involveret i morfogenese, og glial cell differentiering.,
Baseret på en omfattende analyse af hydroxymethylation differentieret gener lister af de tre grupper, vi udvalgt seks hypo-DhMRs forbundet gener fra HI-gruppe, der var alle, der er forbundet med de funktioner i nervesystemet til at undersøge forholdet mellem 5 hm ændringer og transskription niveauer af disse gener., Som forventet blev det konstateret, at i overensstemmelse med den reducerede 5 hmC-modifikation i Casd1, Prkg2 og Slc44a1 blev de tilsvarende mRNA-niveauer også signifikant reduceret i HI-gruppen sammenlignet med dem i kontrol-og Tuina-grupper (figur 5(f)).
4. Diskussion
med generel sikkerhed og anset effekt accepteres traditionel kinesisk medicin (TCM) let af den generelle befolkning over hele verden. TCM er blevet anvendt i vid udstrækning i forskellige pædiatriske sygdomme, såsom e .ings sarkom , astma , Graves’ sygdom og pædiatriske allergiske lidelser ., I mellemtiden er der også undersøgelser, der tyder på, at TCM-terapier, herunder Tuina, plantelægemidler og akupunktur, tolereres godt og har positive terapeutiske virkninger på cerebral parese . På grund af de lovende kliniske resultater og færre bivirkninger har Kinesisk Tuina massage tiltrukket voksende interesse med hensyn til behandling af CP.
som en ny epigenetisk modifikation tjener 5 hmC ikke kun som et mellemprodukt af DNA-demethyleringsprocesser, men virker også som en stabil epigenetisk markør under udvikling af forskellige sygdomme ., 5 hmC er cirka ti gange mere beriget i neuroner end i andre celler, og dens dynamiske regulering er kritisk ved postnatal neuroudvikling . Desuden er ændringen af det globale 5 hmC-niveau blevet betragtet som tæt forbundet med mange neurodegenerative lidelser og neuroudviklingssygdomme .
efter vores bedste viden har få undersøgelser imidlertid været fokuseret på forbindelsen mellem DNA-hydro .ymethylering og cerebral parese, som blev inspirationen til vores forskning., I vores undersøgelse afslørede resultaterne af dot blotting og immunofluorescens, at det globale 5 hmC-niveau i den cerebrale temporale lobe Corte .var signifikant reduceret efter HI-skade, hvilket er i overensstemmelse med det reducerede 5 hmC-niveau i musen nyre efter iskæmi-reperfusion. Efter Tuina-behandling var 5 hmC-niveau i Tuina-gruppen imidlertid højere end i HI-gruppen., Endvidere er det kendt, at 5 hmC produceres via o .idation af 5 mC af Tet-proteiner, baseret på hvilke vi påviste niveauerne af Tet1-og Tet2-proteiner og fandt, at begge niveauer blev signifikant reduceret efter HI-skade, hvorimod kun Tet2-protein blev forøget efter Tuina-behandling. I alt indebærer disse fund, at den reducerede Tet1-og Tet2-ekspression kan bidrage til faldet i 5 hmC efter HI-skade, og Tuina kan øge 5 hmC-niveau via forstærkende Tet2-ekspression.,
tværtimod blev CGI-methylering hos promotorer fundet kritisk ved genhæmning, og 5 hmC kan spille en rolle i genekspression medieret af DNA-demethylering . I vores undersøgelse viste HI-gruppen nedsat berigelse af genom-dækkende 5 hmC i CGI inden for 500 bp af TSS sammenlignet med kontrol-og Tuina-grupper, mens Tuina øgede genom-bred distribution af 5 HMC., I mellemtiden, i overensstemmelse med tidligere konklusioner om, at berigelse af 5 hm i genet krop måske har en stærk korrelation med øget transskription af den pågældende gener i neuroner , vores RT-PCR-resultaterne viste, at nedbrydningen af 5 hm ændring i Prkg2, Casd1, og Slc44a1 gen var ledsaget af nedsat mRNA niveauer af disse gener i HI-gruppen., Baseret på alle disse resultater, der er nævnt ovenfor, blev det nævnt, at 5 hm ændring kan spille en kritisk rolle i patogenesen af CP gennem regulering af transkription og udtryk af gener relateret til neuronal funktioner og Tuina kan producere terapeutiske virkninger på CP via modulerende 5 hm.
mere interessant blev det konstateret, at CP og relaterede udviklingsforstyrrelser er mere almindelige set hos mandlige patienter , og kvindelig neonatal musemodel af HI-hjerneskade viste også kønsspecifik lavere forekomst af CP, hvis årsag stadig er usikker., For at undgå forstyrrelsen fra denne mulige kønsspecifikke beskyttelseseffekt blev kun mandlige rotteunger valgt til vores undersøgelse. Det er bemærkelsesværdigt, at i genome-wide cirkulære kort (Figur 5(a)), store forskelle i fordelingen af hyper-DhMRs og hypo-DhMRs på X-kromosomet blev observeret fra en sammenligning mellem to grupper i vores undersøgelse, hvilket yderligere bekræfter, at sammenhængen mellem køn og forekomsten af cerebral parese., På grund af begrænsningerne i vores laboratorium kunne vi ikke foretage IgG-kontrol eller generere inputbibliotekerne, og Dhmr ‘ er blev identificeret ved direkte at sammenligne den ene med den anden snarere end at sammenligne med input, som vi vil have til hensigt at forbedre i vores fremtidige undersøgelser for at gøre forskningen mere præcis.desuden viste GO-analyser af hypo-DhMRs-associerede gener i HI-gruppen, at disse gener er stærkt beriget i flere signalveje relateret til neuroudvikling og neuronale funktioner., I vores eksperiment optrådte væksthæmning og neuroudviklingsforstyrrelser i HI-gruppen i form af vægttab, svaghed i lemstyrke og adskillige neuronale refleksforstyrrelser, som i nogen grad blev forbedret ved Tuina-behandling. Desuden, ud fra resultaterne af Morris water maze test og step-down undgåelse test, Tuina bedre indlæring og hukommelse for funktioner af hypoxisk-iskæmisk rotter betydeligt., Disse resultater viser korrelationen mellem ændringen i 5-hydroxymethylcytosine loci og neuronale udvikling og furtherly tyder på, at Tuina behandling kan påvirke hjernens udvikling og hjernens kognitive funktioner via modulerende DNA hydroxymethylation.
i den foreliggende undersøgelse leverede vi genom-dækkende 5 hmC-kort over kontrol -, hej-og Tuina-grupper og afslørede ændring i DNA-hydro .ymethyleringsstatus og 5 HMC dynamisk ændring efter Tuina-behandling, hvilket kan kaste lys over den mulige terapeutiske mekanisme for Tuina for CP.,
datatilgængelighed
de data, der bruges til at understøtte resultaterne af denne undersøgelse, er tilgængelige fra den tilsvarende forfatter efter anmodning.
interessekonflikter
forfatterne erklærer, at der ikke er nogen interessekonflikter.
Forfatteres Bidrag
Yunpeng Zhang og Chao Gao bidraget ligeligt til dette arbejde.,
Tak
Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (81774444), Henan-Provinsen Videnskab og Technology Research Project (182102310403), Kina og Canada Kooperative Klinisk forskningsprojekt, Henan-Provinsen for at Studere i Udlandet Program (201721), og Henan-Provinsen Medicinsk Videnskab og Technology Research Project (Provins og Ministeriet for Byggeriet) (201701034).