Abstrakt
I tillegg til misdannelser av motor og holdning, barn med cerebral parese (CP) har ofte intellektuell funksjonsevne. Som en komplementær og alternativ tradisjonell Kinesisk medisin (TCM) terapi, Kinesisk Tuina massasje, også kalt Tuina i Kina, har vært mye brukt i klinisk behandling for CP i Kina for en lang tid. Imidlertid, den molekylære basisen for dette er fortsatt i stor grad ukjent., Nylig, DNA hydroxymethylation har vist seg å være følsomme for miljø og spiller viktige roller i visse nevrologiske lidelser, mens den forskning som fokuserer på forholdet mellom 5 hmC og Tuina behandling for cerebral parese er mangelfull. I vårt arbeid har vi observert at Tuina bedre læring og hukommelse funksjoner av hypoksisk-iskemisk (HI) rotte unger. I mellomtiden, 5 hmC nivå av tinninglappen cortex i HI neonatal rotte modellen er redusert betydelig i forhold til det av rotter i kontroll-og Tuina grupper., Deretter brukte vi hMeDIP-Seq metode for å utforske hvorvidt og hvordan DNA hydroxymethylation er involvert i Tuina behandling for cerebral parese. Genomisk markering av DhMRs av HI konsernets hypo-hydroxymethylation til gener avslørt berikelse i flere nevrologiske signaliserer trasé. Videre fant vi uttømming av 5 hmC endringer i gener assosiert med nevronal utvikling ble ledsaget av redusert mRNA-nivåer av disse genene., Tatt sammen, og våre resultater tyder på at Tuina kan regulere uttrykk for neurodevelopment-relaterte gener ved å endre statusen av DNA hydroxymethylation, og dermed forbedre læring og hukommelse funksjoner av cerebral parese.
1. Innledning
Cerebral skade som oppstår under perinatal perioden er en viktig årsak for ervervet funksjonshemming., Forekomsten av cerebral skade hos spedbarn er korrelert med flere faktorer, slik som hypoxia-iskemi, infeksjon, oksidativt stress, og inflammatorisk respons som blant hypoxia-iskemi (HI) kan indusere cerebral parese (CP) ved å utløse perinatal cerebrale lesjoner i tidlig fødte . CP er den vanligste neonatal kronisk funksjonshemming, preget av motor og postural nedskrivninger, og er ofte ledsaget av kognitive og læring underskudd . I grunnleggende vitenskap, studier, HI neonatal rat-modellen har vært mye brukt i å utforske atferds utfall og patogenesen av cerebral parese ., Til tross for stor fremgang i CP-studier av molekylære mekanismer for hvordan hypoxia-iskemi bidrar til CP utvikling og progresjon fortsatt opphold uklare.
Til denne dag, den aktuelle behandlingsformer for CP omfatter i hovedsak ortopedisk kirurgi, antispasticity medisiner, og ulike typer motoriske læring intervensjoner , de fleste som bare jobber for å behandle komplikasjoner relatert til CP og kan gi bivirkninger., Imidlertid, tradisjonell Kinesisk medisin (TCM), inkludert Tuina, akupunktur og urtemedisin, alene eller kombinert med konvensjonell terapi av vestlig medisin, har vært mye brukt som et alternativ behandling for CP i Kina . Tuina er en gammel form for medisinsk massasje i Kinesisk medisin, med anvendt trykk med fingeren for å acupoints som er angivelige sensibilisert av organ verdifall . Spesielt, Tuina, som et tryggere og mer effektiv intervensjon, har vist tydelige effekter på cerebral parese i klinisk praksis. Imidlertid, den eksakte mekanismen for hvordan Tuina fungerer på CP ikke har blitt belyst.,
tvert imot, pathogenically, miljø-sensitive epigenetisk endringer har allerede vist seg å være involvert i neurogenesis , læring og hukommelse , og synaptisk plastisitet . Blant ulike epigenetisk modifikasjoner, DNA-metylering på den femte av karbon cytosine (5-methylcytosine, 5 mC) er den mest omfattende studert epigenetisk endring som spiller viktige roller i chromatin struktur remolding, transcriptional undertrykkelse, og cellulær differensiering ., Videre oksidasjon av 5 mC inn i 5-hydroxymethylcytosine (5 hmC) av de ti-elleve translocation (TET) – genet familie er foreslått som en ny mekanisme for fjerning av 5 mC , og 5 hmC har blitt foreslått å være kritisk i vedlikehold av nevron struktur og funksjoner på grunn av sin åpenbare berikelse i hjernen . I mellomtiden, 5 hmC endring er også identifisert av mange studier for å bli assosiert med nevrologiske lidelser, som for eksempel Alzheimers sykdom , Rett syndrom , skjøre X-forbundet tremor/ataksi syndrom , Huntington ‘ s sykdom , og autismespekterforstyrrelser ., Disse bevisene gitt grunnlag for hypotesen om at 5 hmC endringer kan spille viktige roller i nervesystemet sykdom.,
for Å utforske tilstedeværelsen av involvering av Tuina behandling i endring av 5 hmC i CP, vi brukt en etablert kjemisk merking og affinitet rensing metode kombinert med høy gjennomstrømning sekvensering teknologi til å avsløre mulige genome-wide 5 hmC endringer i HI rotter før og etter Tuina behandling for å søke forholdet mellom 5 hmC og Tuina terapeutiske effekter på CP, og dermed gi bevis for å støtte bruk av Tuina behandling for cerebral parese.
2. Materialer og Metoder
2.1., Dyr Modell
Alle eksperimenter ble godkjent av Etisk Komité for Dyr Omsorg av Jinshan Sykehus tilknyttet, Og Universitetet. En modifisert Ris–Vannucci-modellen ble brukt som tidligere beskrevet . Den neonatale HI-modellen ble utført på Sprague-Dawley mannlige rotte unger (Slac Laboratory Animal Selskapet, Shanghai, Kina) på postnatal dag 3 (P3) via ligation av venstre vanlige carotisar under 3% isofluran anestesi. Kirurgi tid for hver rotte ble kontrollert i løpet av 10 minutter., Etter gjenoppretting for 1 time, disse ungene ble plassert i en hypoxia kammer ved 37°C og er underlagt gass mikser består av 8% O2 og 98% N2 for 3,5 timer. Humbug dyr hadde den samme operasjonen for å avdekke vanlige carotisar uten ligation og hypoksi. Etter operasjonen, rotte ungene var returnert til sine hjem buret.
2.2. Tuina Behandling
Tuina behandling ble utført av en spesialisert forsker med profesjonell lege sertifikat. Fra den dagen av P4 til P31, rotte unger i Tuina gruppe akseptert Tuina inngrep som er utført 120 ganger/min for 15 minutter, en gang i døgnet.,f Tuina er som følger: for det første, rotte ble plassert på håndflaten av manipulatoren venstre hånd til å tilpasse seg til miljøet, for det andre, manipulatoren brukt langfingeren av sin høyre hånd til å gni forsiktig rotte fra nakken til halen tre ganger for å slappe av sin muskler; for det tredje, Tuina ble utført av påfølgende rubbing, elting, og en finger presser langs ryggraden av rotter fra topp til bunn og fra innsiden og ut på dorsum og ambilateral leddbånd samt musklene langs den du meridian og blære midte rotte med referanse til relatert tradisjonell Kinesisk medisin (TCM) fungerer.,
2.3. Rettende Refleks
Rettende refleks av neonatal rotter ble vurdert fra P5 til P11, som beskrevet før . Under denne testen, rotte ungene var plassert i en liggende posisjon på en rengjort flate og klokkeslett for disse ungene å reachieve liggende posisjon med alle fire labbene ble målt.
2.4. Gangart Refleks
Rotte ungene var plassert i midten av en hvit avrundet papp (13 cm i diameter), og den dag når de flyttet av sirkel med både forelimbs ble spilt inn .
2.5., Skråplanet Test
Denne testen ble benyttet for å måle lem styrke ved å ta opp den maksimale vinkelen på skråningen på som rotte unger kan fortsatt klarer å holde på den dagen P21, som vist i Figur 1(b) . Under denne testen, rotter ble plassert mot høyre eller venstre og vinkelen på flyet ble økt med 5° hvert femte sekund for å bestemme den maksimale vinkelen på skråningen som rotte kan fortsatt holder .
2.6. Step-Down Unngå Test
Denne testen ble gjennomført for å måle oppbevaring av minne . En rotte var forsiktig plassert på en sylindrisk isolasjon plattform (4.,5 cm i diameter og høyde) i en conditioning kammeret for å tilpasse seg omgivelsene etter 3 min. Når rat-trinn ned på plattformen, vil det være elektrifisert umiddelbart. I 5-minutters-trening (P26), rotter ble opplært til å hoppe tilbake til plattform for å unngå elektrisk stimulering. I testen økter (24 t etter trening, dvs., P27), ventetid tid (tiden for rotter til å gå ned fra plattform for første gang), og antall feil (frekvens av rotter stepping ned fra plattformen) ble registrert.
2.7., Morris Vann Maze (MWM) Test
for å vurdere romlig læring og minne, Morris vann labyrint testen ble utført i 5 dager som tidligere beskrevet . Vannet maze (Shanghai Xinyuan Informasjon Teknologi Selskapet, Shanghai, Kina) var delt inn i fire kvadranter, og en plattform (5 cm i diameter) var plassert 1 cm under vannflaten i en kvadrant. I opplæringen økter (P27–P30), alle rottene ble trent fire ganger om dagen i fire dager på rad, og de fikk lov til å finne de skjulte plattform innen 60 s., Hvis rottene ikke klarte å finne plattformen i 60 s, det var forsiktig guidede til plattform og lov til å holde på den i 30 sekunder før du blir sendt tilbake til buret. På dagen for den romlige probe trial (P31), plattformen ble fjernet og rotter ble gitt ut i vannet som vender mot bassenget veggen fra samme posisjon som i treningen. Senere, bevegelse spor og antall plattform beliggenhet kryssinger ble registrert.
2.8., Dot Blotting
Etter ferdigstillelse av de ovennevnte tester, rotte ungene var ofret på P31 og deres hjerner ble dissekert for å samle inn totalt DNA fra venstre temporal cortex av en QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Tyskland). 2.5 µL genomisk DNA (100 ng/µL) ble oppdaget på nylon membraner etterfulgt av bakervarer på 80°C i 30 min til cross-link-DNA . Etter å blokkere med 5% nonfat melk til 1 time ved romtemperatur, membranen ble inkubert med polyklonale 5 hmC antistoff (1 : 1000 fortynning, Aktiv Motiv, Usa, Cat. Ingen., 39769) ved 4°C over natten og pepperrot peroksidase (HRP)-sekundært antistoff som er konjugert ble brukt til å undersøke neste dag. Dot blot membranen ble farget med 0.02% methylene blå (MB) for å sikre lik lasting.
2.9. Hydroxymethylated DNA Immunoprecipitation (hMeDIP) Analyse og Høy Gjennomstrømning Sekvensering
Genomisk DNA ble ekstrahert fra venstre temporal cortex av rotte unger (kontroll: n = 3; HI: n = 3; Tuina: n = 3) og sonicated å 200-350 base-par (bp). Og DNA-fragmentene var slutten reparert; En-tailed og Illumina-adaptere var ligated., Så, adapter-ligated DNA ble denaturert og inkubert med 5 hmC antistoff (Aktiv Motiv, Usa, Cat. Nr 39769) ved 4°C over natten. Antistoff-DNA komplekser ble tatt til fange av protein A/G perler. Den immunoprecipitated DNA ble renset og gjennomgikk høy gjennomstrømning sekvensering utført på Illumina HiSeq3000 system (Illumina, Usa) .
2.10. Kartlegging av Sekvensering Data og Bioinformatikk
Behandling av sekvensering av data ble utført som beskrevet tidligere . FASTQ sekvens filer etter biologiske duplikasjoner ble justert å UCSC rotte referanse genom (RGSC6.0/6) ., Unik, nonduplicate leser ble brukt for topp ringer og kommenteres av hypergeometric optimalisering av motiv i vannmassene (HOMER) . 5-hmC berikelse topper ble fastsatt ved bruk av en modell-basert analyse av ChIP-Seq (MAC) programvare . Og differentially hydroxymethylated regioner (DhMRs) ble identifisert blant alle par av 5-hmC-beriket prøver ved direkte sammenligning av én prøve med en annen i hver retning . Gene ontology (GO) – analyser ble utført ved hjelp av DAVID .
2.11. Kvantitativ RT-PCR
Total RNA ble ekstrahert fra venstre tinninglapp cortex., Revers transkripsjon av cDNA ble utført ved hjelp av PrimeScript RT Master Mix-Kit (Takara, Japan). Kvantitativ RT–PCR reaksjoner ble utført på 7500 real-time PCR-system (Applied Biosystems, Usa) med SYBR green (Takara, Japan). β-actin ble brukt som en intern kontroll, og i forhold uttrykk for mål-genet ble bestemt av 2−ΔΔCT metode., The sequences of primers used in the present experiment were listed as follows: Prkg2 primer (forward 5′-CCTCTGGATGTTCACCGCAAGAC-3′, reverse 5′-AGGTCATAGGTCCGGCTTGTGG-3′), Casd1 primer (forward 5′-GAGAGCAGACGGATGAATGGAAGG-3′, reverse 5′-AACAGATAAGCAGCCACCAGAACG-3′), Slc44a1 primer (forward 5′-ACACAGCCACAGCCATCAATAGC-3′, reverse 5′-CAGCCACTCGCAGAGCATTCTC-3′), and β-actin primer (forward 5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′, reverse 5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′).
2.12., Western Blotting Analysen
Den isolerte venstre tinninglapp cortex ble lagt med iskald protein lysate og sentrifugerte på 12000 o/min 20 min ved 4°C. Protein prøvene ble separert ved elektroforese ved hjelp av SDS-PAGE og overført til PVDF membran (Millipore, Usa). Etter å blokkere med 5% nonfat melk for 2 h ved romtemperatur, membranen ble inkubert med den primære antistoffer ved 4°C over natten, og deretter inkubert med HRP-konjugert videregående IgG-antistoffer. Den primære antistoffer som brukes her, inkludert anti-Tet1 (1 : 1000, Abcam, STORBRITANNIA, Cat. Ingen., 191698), anti-Tet2 (1 : 1000, Millipore, Usa, Cat. # ABE364), anti-Slc44a1 (1 : 1000, Abcam, STORBRITANNIA, Cat. Nr 110767), og anti-β tubulin (1 : 2000, Celle Signaliserer Teknologi, Usa, Cat. #2128). Membraner ble deretter utviklet ved hjelp av ECL oppdagelse, og signalene ble registrert med Tanon-5200 Luminescent Imaging System (Tanon, Shanghai, Kina). Protein-nivå ble analysert med Bilde J programvare (NIH, Bethesda, USA) og normalisert til tilsvarende β-tubulin nivå.
2.13., Immunfluorescens Konfokal Mikroskopi
Rotte ungene var ofret på P31, og deres hjerter var perfused med 0.9% saltløsning etterfulgt av 4% paraformaldehyde (PFA). Etter perfusjon, hjernen ble dissekert og fast i 4% PFA over natten, etterfulgt av å være forankret i parafin og gjort om til 5 mikrometer seriell seksjoner. Etter mikrobølgeovn antigen henting i sitronsyre buffer på 95°C, uspesifikke steder ble blokkert med 5% bovint serum albumin (BSA) for 1 time ved romtemperatur. Neste, hjernen seksjoner ble inkubert med 5 hmC primære antistoff (1 : 1000, Aktiv Motiv, Usa, Cat. Ingen., 39769) over natten ved 4°C etterfulgt av inkubasjon med det sekundære antistoffet (1 : 200, Liv Technology, Usa) 1 h ved 37°C. 4′,6-diamino-2-phenylindole (DAPI) ble brukt for kjernefysisk immunfluorescens flekker, og immunfluorescens bildene ble visualisert og fanget på en konfokal mikroskop (Leica sp5, Tyskland).
2.14. Statistiske Analyser
Alle data som ble uttrykt som gjennomsnitt ± standard error of the mean (SEM) og analysert ved hjelp av SPSS., En-veis analyse av varians (ANOVA) ble brukt til å bestemme forskjeller mellom 3 grupper, etterfulgt av nonparametric t-test og Tukey ærlig betydelig forskjell test. verdi <trinn på 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
3. Resultater
Tuina forbedret vekttap, svakhet i ben styrke, og lidelser nevrologiske reflekser indusert av HI.,
kroppsvekt av rotte unger ble målt fra P4 til P28, og det ble funnet at, fra P22 å P28, kroppsvekt av rotter i Tuina-gruppen (n = 11) økt vesentlig i forhold til HI-gruppen (n = 11; Figur 1(a)). Resultatene av skråplanet test viste at den maksimale vinkler var høyere i Tuina gruppe enn de i HI-gruppen (Figur 1(b)), som indikerte forbedring i den svake lemmer styrke i Tuina-gruppen., Resultatene av nervesystemet reflekser var som følgende: i gangart reflekser test, rotte unger i HI-gruppen begynte å bevege seg bort fra kretsen med både forelimbs betydelig senere enn de som er i kontroll-og Tuina grupper (Figur 1(c)). I den rettende refleks test, rotter i Tuina-gruppen tok kortere tid til å høyre seg selv enn de i HI gruppe fra P7 å P11 (Figur 1(d)).
Tuina fremmet læring og hukommelse funksjoner av hypoksisk-iskemisk rotte unger.,
Morris vann labyrint test og step-down testen ble utført for å evaluere læring og hukommelse funksjoner av rotter. Som vist i Figur 2(a), bevegelse spor på proben rettssaken dag av MWM test viser at antall plattform beliggenhet kryssinger av HI-gruppen var vesentlig mindre enn kontroll-gruppen og Tuina-gruppen (Figur 2(b)). I step-down-test HI rotter viste signifikant kortere ventetid og flere feil i forhold til kontroll og Tuina rotter (Figur 2(c) og 2(d)).
Tuina økt 5 hmC og Tet2 nivåer i cerebral temporal cortex av HI rotter.,
for Å undersøke om nivået av 5 hmC var påvirket under CP utvikling, har vi utført dot blot tester og observert at 5 hmC nivå av HI rotter redusert betydelig i forhold til at av kontroll, mens dette nivået var delvis økt etter Tuina (; Figur 3(a)). I mellomtiden, immunfluorescens farging vist sammenslåing av 5 hmC og DAPI farging og HI ført til nedgang i genomisk 5 hmC i venstre temporal cortex, mens Tuina behandling restaurert 5 hmC nivå til en viss grad (Figur 3(b)), som var i samsvar med resultatene av dot blotting., Videre, som vist i figur 3(c) og 3(d), HI-gruppen vises redusert Tet1 og Tet2 uttrykk i forhold til kontrollgruppen, mens bare Tet2 ble økt etter Tuina behandling.
3.1. Genome-Wide 5 hmc Endring og Distribusjon
for Å undersøke presis plassering og fordeling av genome-wide 5 hmc, hydroxymethylated DNA immunoprecipitation (hMeDIP) etterfulgt av neste generasjons sekvensering (hMeDIP-seq) ble gjennomført., Rotter, henholdsvis fra Kontroll (n = 3), HI (n = 3) og Tuina (n = 3) grupper ble ofret på P31, og genomisk DNA fra venstre tinninglapp cortex ble tatt ut for hMeDIP-seq. Genome-wide mønster av 5 hmC nivå ble vurdert ved å telle 5 hmC-kartlagt leser i hver 10 kb bin fra prøvene av kontroll, Tuina, og HI grupper og så normalisert til den totale sekvensering dekning . Som vist i figur 4(a)-4(c), distribusjon av genome-wide 5 hmC leser i de tre gruppene var forskjellige, og da vi videre utforsket det spesifikke genet områder der disse forskjellene finnes., Figur 4(d) viser overlappende funksjoner av normalisert tetthet av 5 hmC leser med kjent genom har på definerte genet organer og CGI (CpG-øyer) i henhold til UCSC tabell for RGSC6.0/6. Videre, som vist i Figur 4(e), og fordelingen av 5 hmC på genet organer og 1 kb opp – og nedstrøms av genet likene ble også studert., Det kan sees fra figur 4(d) og 4(e) at 5 hmC nivå av HI-gruppe skilte seg fra de av kontrollgruppen og Tuina-gruppen i 5′ enden av genomisk kroppen, spesielt på områder av ±500 bp av transcriptional starte nettsteder (TSS) og CGI innenfor 500 bp av TSS.
3.2. Identifikasjon og Kommenteres av Differentially Hydroxymethylated Regioner (DhMRs)
for Å finne den spesifikke loci stiller endret 5 hmC profiler, vi fortsatte å identifisere og karakterisere de spesifikke DhMRs av alle autosomes og sex kromosomer over genom., Det er interessant at det var stor forskjell i fordelingen av hyper-DhMRs og hypo-DhMRs på X-kromosomet (figur 5(a)-5(c)). Å utforske den biologiske betydning av funnet DhMRs, gener som er assosiert med disse DhMRs ble trukket ut for gene ontology (GÅ) berikelse analyse., Som vist i figur 5(d) og 5(e), kan du GÅ berikelse analyse indikerte at disse hypo-DhMRs i HI-gruppen ble det funnet høyt anriket på den funksjonelle trasé i slekt å neurodevelopment og nevrale funksjoner, inkludert utviklingsmessige cellevekst, nevron projeksjon extension, positiv regulering av utviklingsmessige vekst, forsinket utvikling vekst involvert i morphogenesis, og glial celledifferensiering.,
Basert på omfattende analyser av hydroxymethylation differensial gener lister over de tre gruppene, har vi valgt seks hypo-DhMRs forbundet gener fra HI-konsernet, som alle var knyttet til funksjonene til nervesystemet til å undersøke forholdet mellom 5 hmC endringer og transkripsjon nivåer av disse genene., Som hva som er forventet, det ble funnet ut at i henhold til den reduserte 5 hmC endring i Casd1, Prkg2, og Slc44a1, tilsvarende mRNA-nivå ble også betydelig redusert i HI-gruppen sammenlignet med de som er i kontroll-og Tuina grupper (Figur 5(f)).
4. Diskusjon
Med generell sikkerhet og anerkjente effekt, tradisjonell Kinesisk medisin (TCM) er lett akseptert av befolkningen over hele verden. TCM har vært mye brukt i ulike pediatric sykdommer, som Ewing sarkom , astma , Graves’ sykdom , og pediatric allergiske lidelser ., Samtidig er det også studier som indikerer at TCM behandlinger, inkludert Tuina, urtemedisin og akupunktur er godt tolerert og har positive terapeutiske effekter på cerebral parese . På grunn av den lovende kliniske resultater og færre bivirkninger, Kinesisk Tuina massasje har fått økende interesse i form av behandling for CP.
Som en ny epigenetisk endring, 5 hmC ikke bare fungerer som en mellomting av DNA-demetylering prosesser, men også fungerer som en stabil epigenetisk markør under utvikling av ulike sykdommer ., 5 hmC er omtrent tidoblet mer beriket i nevroner enn i andre celler, og dens dynamiske forordning er kritisk i postnatal neurodevelopment . Videre, endring av det globale 5 hmC nivå har vært ansett som nært knyttet til mange nevrodegenerativ lidelser og nevrologiske sykdommer .
Imidlertid, til det beste av vår kunnskap, få studier har fokusert på sammenhengen mellom DNA hydroxymethylation og cerebral parese, som ble inspirasjon for vår forskning., I vår studie, og resultatene av dot blotting og immunfluorescens åpenbart at den globale 5 hmC nivå i cerebral tinninglappen cortex ble betydelig redusert etter HI skade, som er konsistent med redusert 5 hmC nivå i musen nyre etter iskemi-reperfusion . Men etter Tuina behandling, 5 hmC nivå i Tuina-gruppen var høyere enn i HI-gruppen., Videre er det kjent at 5 hmC er produsert via oksidasjon av 5 mC med Tet proteiner, basert på at vi oppdaget nivåer av Tet1 og Tet2 proteinene og funnet at begge nivåer ble betydelig redusert etter HI skade, mens bare Tet2 protein ble økt etter Tuina behandling. I alle disse funnene antyder at redusert Tet1 og Tet2 uttrykk kan bidra til reduksjon i 5 hmC etter HI skade og Tuina kan øke 5 hmC nivå via styrke Tet2 uttrykk.,
tvert imot, CGI-metylering i arrangører ble funnet kritisk i genet lyddemping og 5 hmC kan spille en rolle i genuttrykk mediert av DNA-demetylering . I vår studie, HI-gruppen vises redusert berikelse for genome-wide 5 hmC i CGI innenfor 500 bp av TSS i forhold til kontroll og Tuina grupper, mens Tuina økt genome-wide distribusjon av 5 hmC., I mellomtiden, i tråd med tidligere funn som berikelse av 5 hmC i genet kan kroppen har en sterk sammenheng med økt transkripsjon av de aktuelle gener i nevroner , våre RT-PCR resultatene viste at nedbryting av 5 hmC endring i Prkg2, Casd1, og Slc44a1 genet ble ledsaget av redusert mRNA-nivåer av disse genene i HI-gruppen., Basert på disse funnene nevnt ovenfor, var det angitt at 5 hmC modifikasjoner kan spille en avgjørende rolle i patogenesen av CP gjennom regulering av transkripsjon og uttrykk av gener knyttet til nevrale funksjoner og Tuina kan gi terapeutiske effekter på CP via modulerende 5 hmC.
Mer interessant, det ble funnet at CP og relaterte utviklingsforstyrrelser er mer vanlig sett i mannlige pasienter og kvinnelige neonatal mus modell av HI hjerneskade også vist kjønns-spesifikke lavere forekomst av CP , grunnen som er fortsatt usikkert., For å unngå forstyrrelser fra dette mulig kjønns-spesifikke beskyttende effekter, bare mannlige rotte ungene var valgt for vår studie. Bemerkelsesverdig, i genome-wide sirkulære kartet (Figur 5(a), og store forskjeller i fordelingen av hyper-DhMRs og hypo-DhMRs på X-kromosomet ble observert fra sammenligningen mellom to grupper i vår studie, noe som ytterligere bekrefter sammenhengen mellom kjønn og forekomsten av cerebral parese., Spesielt, på grunn av begrensninger i vår lab, vi kunne ikke gjøre IgG-kontroll eller generere input biblioteker, og DhMRs ble identifisert ved direkte sammenligning den ene til den andre heller enn å sammenligne med innspill, som vi har til hensikt å forbedre i vår fremtidige studier å gjøre forskning mer presis.
Videre, GÅ analyser av hypo-DhMRs-forbundet gener i HI-gruppen viste at disse genene er høyanriket i flere signalanlegg trasé i slekt å neurodevelopment og nevrale funksjoner., I vårt eksperiment, veksthemming og nevrologiske lidelser dukket opp i HI-gruppen i form av vekttap, svakhet i ben styrke, og flere neuronal refleks lidelser som ble forbedret med Tuina behandling til en viss grad. Videre, fra resultatene av Morris vann labyrint test og step-down unngå test, Tuina bedre læring og hukommelse funksjoner av hypoksisk-iskemisk rotter betydelig., Disse resultatene indikerer korrelasjon mellom endring i 5-hydroxymethylcytosine loci og nevronal utvikling og furtherly tyder på at Tuina behandling kan påvirke hjernens utvikling og cerebral kognitive funksjoner via modulerende DNA hydroxymethylation.
I denne studien, forutsatt at vi genome-wide 5 hmC kart av kontroll, HI, og Tuina grupper og avslørt endring i DNA-hydroxymethylation status og 5 hmC dynamisk endring etter Tuina behandling, som kan kaste lys over mulige terapeutiske mekanisme av Tuina for CP.,
Data
De data som brukes til å støtte funnene i denne studien er tilgjengelig fra samme forfatter på forespørsel.
Interessekonflikter
forfatterne hevder at det er ingen interessekonflikter.
Forfatternes Bidrag
Yunpeng Zhang og Chao Gao bidratt like mye til dette arbeidet.,
Erkjennelsene
Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (81774444), Henan-Provinsen Science and Technology Research Project (182102310403), Kina-Canada Samarbeidende Kliniske Forskningsprosjekt, Henan-Provinsen Studere i Utlandet Program (201721), og Henan-Provinsen Medisinsk Vitenskap og Teknologi Forskningsprosjekt (Provincial og Departementet byggeprosjekt) (201701034).