Streszczenie
oprócz zaburzeń ruchowych i postawy dzieci z porażeniem mózgowym (CP) często mają niepełnosprawność intelektualną. Jako komplementarna i alternatywna terapia tradycyjnej medycyny chińskiej (TCM), chiński masaż Tuina, zwany także Tuina w Chinach, od dawna jest szeroko stosowany w leczeniu klinicznym CP w Chinach. Jednak molekularna podstawa tego zjawiska pozostaje w dużej mierze nieznana., Ostatnio wykazano, że hydroksymetylacja DNA jest wrażliwa na środowisko i odgrywa kluczową rolę w niektórych zaburzeniach neurologicznych, podczas gdy badania koncentrujące się na związku między 5 HMC a terapią Tuina w mózgowym porażeniu dziecięcym są niewystarczające. W naszym badaniu po raz pierwszy zaobserwowaliśmy, że Tuina poprawiła funkcje uczenia się i pamięci niedotlenczo-niedokrwiennych (HI) szczeniąt szczurów. Tymczasem poziom 5 hmC kory płata skroniowego w modelu Hi noworodków szczurów jest znacznie zmniejszony w porównaniu do szczurów w grupach kontrolnych i Tuina., Następnie użyliśmy metody hMeDIP-Seq, aby zbadać, czy i w jaki sposób hydroksymetylacja DNA jest zaangażowana w terapię Tuina w mózgowym porażeniu dziecięcym. Genomiczna adnotacja DhMRs Hi group ' s hypo-hydroxymethylation geny ujawniać wzbogacanie w wielu neurodevelopmental sygnalizacyjnych szlakach. Ponadto stwierdzono, że wyczerpaniu 5 modyfikacji hmC w genach związanych z rozwojem neuronów towarzyszył obniżony poziom mRNA tych genów., Razem, nasze wyniki wskazują, że Tuina może regulować ekspresję genów związanych z neurorozwojem poprzez zmianę statusu hydroksymetylacji DNA, poprawiając w ten sposób funkcje uczenia się i pamięci mózgowego porażenia dziecięcego.
1. Wprowadzenie
uraz mózgu występujący w okresie okołoporodowym jest główną przyczyną nabytej niepełnosprawności., Występowanie urazu mózgu u niemowląt jest skorelowane z wieloma czynnikami, takimi jak niedotlenienie-niedokrwienie, infekcja, stres oksydacyjny i odpowiedź zapalna, wśród których hipoksja-niedokrwienie (HI) może wywołać mózgowe porażenie dziecięce (CP) poprzez wywołanie okołoporodowych zmian mózgowych u wcześniaków . CP jest najczęstszą przewlekłą niepełnosprawnością noworodków, charakteryzującą się upośledzeniem ruchowym i posturalnym, a często towarzyszą jej deficyty poznawcze i uczenia się . W podstawowych badaniach naukowych model szczurów noworodkowych HI jest szeroko stosowany w badaniu wyników behawioralnych i patogenezy mózgowego porażenia dziecięcego ., Pomimo wielkiego postępu w badaniach CP, molekularne mechanizmy tego, w jaki sposób niedotlenienie-niedokrwienie przyczynia się do rozwoju i progresji CP, nadal pozostają niejasne.
do dziś obecne terapie dla CP obejmują głównie chirurgię ortopedyczną, leki przeciwpastyczne i różnego rodzaju interwencje uczenia się silnika, z których większość działa tylko w leczeniu powikłań związanych z CP i może powodować skutki uboczne., Jednak tradycyjna medycyna chińska( TCM), w tym Tuina, akupunktura i ziołolecznictwo, samodzielnie lub w połączeniu z konwencjonalną terapią medycyny zachodniej, była szeroko stosowana jako alternatywne leczenie CP w Chinach . Tuina jest starożytną formą masażu medycznego w medycynie chińskiej, z nałożonym naciskiem palców na akupunktury, które są przypuszczalnie uwrażliwione przez zaburzenia narządów. W szczególności Tuina, jako bezpieczniejsza i skuteczniejsza interwencja, wykazała oczywisty wpływ na Mózgowe Porażenie Dziecięce w praktyce klinicznej. Jednak dokładny mechanizm działania Tuina na CP nie został jeszcze wyjaśniony.,
przeciwnie, udowodniono, że patogenetyczne modyfikacje epigenetyczne wrażliwe na środowisko są już zaangażowane w neurogenezę , uczenie się i pamięć oraz plastyczność synaptyczną . Wśród różnych modyfikacji epigenetycznych, metylacja DNA na piątym węglu cytozyny (5-metylocytozyna, 5 mC) jest najintensywniej badaną modyfikacją epigenetyczną, która odgrywa ważną rolę w odbudowywaniu struktury chromatyny, supresji transkrypcyjnej i różnicowaniu komórkowym ., Ponadto utlenianie 5 mC do 5-hydroksymetylocytozyny (5 hmC) przez rodzinę genów translokacji ten-eleven (TET) jest zaproponowane jako nowy mechanizm usuwania 5 mC , a 5 HMC zostało zasugerowane jako krytyczne w utrzymaniu struktury i funkcji neuronu ze względu na jego oczywiste wzbogacenie w mózgu . Tymczasem 5 zmiana hmC jest również identyfikowana przez wiele badań jako związana z zaburzeniami neurologicznymi, takimi jak choroba Alzheimera , zespół Retta , kruche drżenie/ataksja związane z X , choroba Huntingtona i zaburzenia ze spektrum autyzmu ., Dowody te dały podstawę do hipotezy, że zmiany 5 hmC mogą odgrywać kluczową rolę w chorobach układu nerwowego.,
aby zbadać obecność udziału terapii Tuina w zmianie 5 hmC w CP, zastosowaliśmy ustaloną chemiczną metodę znakowania i oczyszczania powinowactwa w połączeniu z wysokowydajną technologią sekwencjonowania, aby ujawnić możliwe zmiany w genomie 5 HMC u szczurów HI przed i po leczeniu Tuina w celu znalezienia związku między 5 HMC i Tuina terapeutyczne efekty na CP, dostarczając w ten sposób dowodów na poparcie stosowania terapii Tuina w porażeniu mózgowym.
2. Materiały i metody
2.1., Model zwierzęcy
wszystkie eksperymenty zostały zatwierdzone przez komitet etyki ds. opieki nad zwierzętami szpitala Jinshan afiliowanego przy Uniwersytecie Fudan. Zastosowano zmodyfikowany model Rice-Vannucci, jak wcześniej opisano . Noworodkowy model HI został wykonany na szczeniakach szczura Sprague-Dawley (SLAC Laboratory Animal Company, Szanghaj, Chiny) W dniu poporodowym 3 (P3) poprzez podwiązanie lewej tętnicy szyjnej wspólnej w znieczuleniu izofluranowym 3%. Czas operacji u każdego szczura był kontrolowany w ciągu 10 minut., Po upływie 1 godziny szczenięta te umieszczano w komorze niedotlenienia w temperaturze 37°C i poddano mieszalnikowi gazu składającemu się z 8% O2 i 98% N2 na 3,5 godziny. Pozorowane zwierzęta miały tę samą operację, aby odsłonić tętnicę szyjną wspólną bez podwiązania i niedotlenienia. Po operacji szczury wróciły do swojej klatki domowej.
2.2. Zabieg Tuina
zabieg Tuina został wykonany przez wyspecjalizowanego naukowca z certyfikatem profesjonalnego lekarza. Od dnia P4 do P31 szczury z grupy Tuina akceptowały interwencję Tuina, która jest przeprowadzana 120 razy / min przez 15 minut, raz dziennie.,f Tuina jest następująca: po pierwsze, szczur został umieszczony na dłoni lewej ręki manipulatora, aby dostosować się do środowiska; po drugie, manipulator użył środkowego palca prawej ręki, aby delikatnie pocierać szczura od szyi do ogona trzy razy, aby rozluźnić jego mięśnie; po trzecie, Tuina została przeprowadzona przez kolejne pocieranie, ugniatanie i pchanie jednym palcem wzdłuż kręgosłupa szczurów od góry do dołu i od wewnątrz na grzbiet i więzadła obustronne, a także mięśnie wzdłuż południka du i południka pęcherza szczura w odniesieniu do pokrewnej tradycyjnej medycyny chińskiej (TCM) działa.,
2.3. Odruch prostowania
odruch prostowania u noworodków szczurów oceniano w zakresie od P5 do P11, jak opisano wcześniej . Podczas tego testu szczury zostały umieszczone w pozycji leżącej na oczyszczonej płaskiej powierzchni, a czas dla tych szczeniąt do osiągnięcia pozycji leżącej wszystkimi czterema łapami został zmierzony.
2.4. Odruch chodu
szczury zostały umieszczone w środku białego zaokrąglonego kartonu (13 cm średnicy), a dzień, w którym ruszyły z koła z obu kończyn przednich został zarejestrowany .
2.5., Badanie pochyłej płaszczyzny
badanie to zostało wykorzystane do pomiaru siły kończyn poprzez zapisanie maksymalnego kąta nachylenia, na który szczenięta szczura mogą nadal się trzymać w dniu P21, jak pokazano na rysunku 1(b) . Podczas tego badania szczury były ustawione w prawo lub w lewo, a kąt nachylenia płaszczyzny zwiększano o 5° co pięć sekund w celu określenia maksymalnego kąta nachylenia, do którego szczur mógł się utrzymać .
2.6. Test unikania stopniowego
ten test został zaimplementowany w celu pomiaru zachowania pamięci. Szczur został delikatnie umieszczony na cylindrycznej platformie izolacyjnej (4.,5 cm średnicy i wysokości) w komorze kondycjonującej, aby dostosować się do otaczającego środowiska przez 3 min. Kiedy szczur zejdzie z peronu, zostanie natychmiast zelektryfikowany. W 5-minutowej sesji treningowej (P26) szczury zostały przeszkolone, aby skakać z powrotem na platformę, aby uniknąć stymulacji elektrycznej. W sesjach testowych (24 h po treningu, tj. P27) zarejestrowano czas opóźnienia (czas, w którym szczury po raz pierwszy ustąpiły z platformy) oraz liczbę błędów (częstotliwość, w której szczury ustąpiły z platformy).
2.7., Morris Water maze (MWM) Test
w celu oceny uczenia się i pamięci przestrzennej, Morris water maze test został przeprowadzony przez 5 dni, jak wcześniej opisano . Labirynt wodny (Shanghai Xinyuan Information Technology Company, Szanghaj, Chiny) został podzielony na cztery ćwiartki, a platforma (o średnicy 5 cm) została umieszczona 1 cm pod powierzchnią wody w jednym ćwiartce. Podczas sesji treningowych (P27–P30) wszystkie szczury były szkolone cztery razy dziennie przez cztery kolejne dni i pozwolono im znaleźć ukrytą platformę w ciągu 60 s., Jeśli szczur nie znalazł platformy w ciągu 60 s, został delikatnie prowadzony na platformę i pozostawiony na niej przez 30 s, zanim został odesłany z powrotem do klatki. W dniu próby sondy przestrzennej (P31) platforma została usunięta, a szczury zostały wypuszczone do wody zwrócone w stronę ściany basenu z tej samej pozycji, co podczas sesji treningowych. Następnie zarejestrowano tory ruchu i liczbę przejazdów peronowych.
2.8., Kropki
Po zakończeniu powyższych testów szczury zostały uśmiercone na P31, a ich mózgi zostały poddane sekcji w celu pobrania całkowitego DNA lewej kory skroniowej za pomocą QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Niemcy). 2,5 µL genomowego DNA (100 ng/µL) wykryto na membranach nylonowych, a następnie pieczono w temperaturze 80°C przez 30 minut, aby usieciować DNA . Po zablokowaniu 5% mlekiem beztłuszczowym przez 1 h w temperaturze pokojowej, membranę inkubowano poliklonalnym przeciwciałem 5 hmC (rozcieńczenie 1 : 1000, Active Motif, United States, Cat. Nie., 39769) w temperaturze 4°C przez noc i skoniugowane przeciwciało wtórne peroksydazy chrzanu (HRP) zostało użyte do badania następnego dnia. Membrana dot blot została zabarwiona 0,02% błękitem metylenowym (MB), aby zapewnić równe obciążenie.
2.9. Hydroksymetylowane DNA Immunoprecypitacja (Hmedip) Analiza i sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości
genomowy DNA został wyekstrahowany z lewej kory skroniowej szczeniąt szczura (Kontrola: n = 3; HI: n = 3; Tuina: N = 3) i sonikowany do par zasad 200-350 (bp). Fragmenty DNA zostały naprawione, a Adaptery a-tailed i Illumina zostały podwiązane., Następnie DNA z adapterem zostało denaturowane i inkubowane 5 przeciwciałami HMC (Active Motif, Stany Zjednoczone, Cat. No. 39769) w 4°C przez noc. Kompleksy przeciwciało-DNA zostały przechwycone przez białko a / G paciorków. Immunoprecypitowane DNA zostało oczyszczone i poddane wysokowydajnej sekwencjonowaniu w systemie Illumina HiSeq3000 (Illumina, Stany Zjednoczone) .
2.10. Mapowanie danych sekwencjonowania i bioinformatyki
przetwarzanie danych sekwencjonowania przeprowadzono jak opisano wcześniej . Pliki sekwencji FASTQ po biologicznych duplikacjach zostały wyrównane do genomu referencyjnego UCSC rat (RGSC6 .0/rn6)., Unikalne, nieduplikowane odczyty były używane do wywoływania pików i adnotacji przez hipergeometryczną optymalizację wzbogacania motywów (HOMER). Piki wzbogacania 5-hmC wyznaczono za pomocą analizy opartej na modelu oprogramowania ChIP-Seq (MACS). I differentially hydroksymetylated regionów (DhMRs) zidentyfikowano wśród wszystkich par próbek wzbogaconych 5-hmC bezpośrednio porównując jedną próbkę z inną w każdym kierunku . Analizy ontologii genów (GO) przeprowadzono przy użyciu DAVID .
2.11. Ilościowy RT-PCR
całkowity RNA został wyekstrahowany z lewego płata skroniowego., Odwrotna transkrypcja cDNA została wykonana przy użyciu zestawu PrimeScript RT Master Mix (Takara, Japonia). Ilościowe reakcje RT-PCR przeprowadzono w systemie PCR w czasie rzeczywistym 7500 (Applied Biosystems, Stany Zjednoczone) przy użyciu SYBR green (Takara, Japonia). β-aktyna została użyta jako kontrola wewnętrzna, a względną ekspresję genu docelowego wyznaczono metodą 2-ΔΔCT., The sequences of primers used in the present experiment were listed as follows: Prkg2 primer (forward 5′-CCTCTGGATGTTCACCGCAAGAC-3′, reverse 5′-AGGTCATAGGTCCGGCTTGTGG-3′), Casd1 primer (forward 5′-GAGAGCAGACGGATGAATGGAAGG-3′, reverse 5′-AACAGATAAGCAGCCACCAGAACG-3′), Slc44a1 primer (forward 5′-ACACAGCCACAGCCATCAATAGC-3′, reverse 5′-CAGCCACTCGCAGAGCATTCTC-3′), and β-actin primer (forward 5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′, reverse 5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′).
2.12., Western Blotting Assay
wyizolowaną lewą korę skroniową dodano lodowatym lizatem białka i odwirowano w temperaturze 12000 r/min przez 20 min w temperaturze 4°C. próbki białka oddzielono elektroforezą przy użyciu SDS-PAGE i przeniesiono na membrany PVDF (Millipore, Stany Zjednoczone). Po zablokowaniu 5% mlekiem beztłuszczowym przez 2 h w temperaturze pokojowej, błony inkubowano z przeciwciałami pierwotnymi w temperaturze 4°c na noc, a następnie inkubowano z przeciwciałami wtórnymi IgG sprzężonymi z HRP. Pierwszorzędowe przeciwciała użyte tutaj obejmowały anty-Tet1 (1 : 1000, Abcam, UK, Cat. Nie., 191698), anti-Tet2 (1: 1000, Millipore, Stany Zjednoczone, kat. # ABE364), anty-Slc44a1 (1: 1000, Abcam, UK, kat. Nr 110767) i anty-β tubuliny (1: 2000, Cell Signaling Technology, Stany Zjednoczone, Nr kat. #2128). Membrany zostały następnie opracowane przy użyciu detekcji ECL, a sygnały zostały wykryte za pomocą systemu obrazowania Chemiluminescencyjnego Tanon-5200 (Tanon, Szanghaj, Chiny). Poziomy białka zostały przeanalizowane przez Image J software (NIH, Bethesda, USA) i znormalizowane do odpowiedniego poziomu β-tubuliny.
2.13., Mikroskopia konfokalna immunofluorescencyjna
szczenięta szczura zostały uśmiercone na P31, a ich serca perfumowano 0,9% soli fizjologicznej, a następnie 4% paraformaldehydu (PFA). Po perfuzji mózgi zostały rozcięte i utrwalone w 4% PFA na noc, a następnie osadzone w parafinie i przekształcone w szeregowe sekcje 5 µm. Po pobraniu antygenu mikrofalowego w buforze kwasu cytrynowego w temperaturze 95°C, niespecyficzne miejsca zostały zablokowane 5% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie sekcje mózgu inkubowano z 5 przeciwciałami pierwotnymi hmC (1 : 1000, Active Motif, United States, Cat. Nie., 39769) przez noc w temperaturze 4°C, a następnie inkubacja z przeciwciałem wtórnym (1: 200, Life Technology, Stany Zjednoczone) 1 h w temperaturze 37°C. 4′,6-diamino-2-fenyloindol (DAPI) został użyty do barwienia immunofluorescencji jądrowej, a zdjęcia immunofluorescencji zostały wizualizowane i przechwycone za pomocą mikroskopu konfokalnego (Leica sp5, Niemcy).
2.14. Analiza statystyczna
wszystkie dane zostały wyrażone jako średnia ± błąd standardowy średniej (SEM) i analizowane za pomocą SPSS., W celu określenia różnic pomiędzy 3 grupami zastosowano jednokierunkową analizę wariancji (ANOVA), a następnie nieparametryczny test t i test tukeya. wartość<0,05 została uznana za statystycznie istotną.
3. Wyniki
Tuina poprawiła utratę wagi, osłabienie siły kończyn oraz zaburzenia odruchów neurologicznych wywołane przez HI.,
masę ciała szczeniąt szczura mierzono od P4 do P28 i stwierdzono, że z P22 do P28 masa ciała szczurów w grupie Tuina (n = 11) znacznie wzrosła w porównaniu do grupy HI (n = 11; rycina 1(A)). Wyniki badania nachylonej płaszczyzny wykazały, że maksymalne kąty były wyższe w grupie Tuina niż w grupie HI (ryc. 1 (b)), co wskazywało na poprawę osłabienia siły kończyn w grupie Tuina., Wyniki odruchów układu nerwowego były następujące: W teście odruchów chodu szczury z grupy HI zaczęły oddalać się od koła z obydwoma kończynami znacznie później niż w grupie kontrolnej i Tuina(ryc. 1 (c)). W teście odruchu prostowania szczury w grupie Tuina zajmowały krótszy czas do prostowania niż szczury w grupie HI Z P7 do P11(Rysunek 1 (d)).
Tuina promowała funkcje uczenia się i pamięci niedotlenczo-niedokrwiennych szczeniąt szczura.,
Jak pokazano na rysunku 2(a), tory ruchu w dniu próby sondy w teście MWM pokazują, że liczba przejść po platformach grupy HI była znacznie mniejsza niż w grupie kontrolnej i grupie Tuina(Rysunek 2 (b)). W teście stopniowym szczury HI wykazały znacznie krótszy czas opóźnienia i więcej błędów w porównaniu do szczurów kontrolnych i Tuina(rysunki 2(c) i 2 (d)).
Tuina zwiększyła poziom 5 hmC i Tet2 w Korie skroniowej mózgu szczurów HI.,
aby sprawdzić, czy poziom 5 HMC został naruszony podczas rozwoju CP, wykonaliśmy testy dot blot i zaobserwowaliśmy, że poziom 5 HMC szczurów HI zmniejszył się znacząco w porównaniu do poziomu kontroli, podczas gdy poziom ten został częściowo zwiększony po Tuina (; Rysunek 3(A)). Tymczasem barwienie immunofluorescencyjne wykazało połączenie barwienia 5 hmC i DAPI, A HI doprowadziło do zmniejszenia genomu 5 hmC w lewej korze skroniowej, podczas gdy leczenie Tuina przywróciło do pewnego stopnia poziom 5 hmC (Rysunek 3(b)), co było zgodne z wynikami plamienia kropkowego., Ponadto, jak pokazano na rysunkach 3 (c) i 3(d), grupa HI wykazywała zmniejszoną ekspresję Tet1 i Tet2 w porównaniu z grupą kontrolną, podczas gdy tylko Tet2 zwiększyła się po terapii Tuina.
3.1. Zmiana i dystrybucja genomu 5 HMC
aby zbadać dokładną lokalizację i dystrybucję genomu 5 HMC, przeprowadzono hydroksymetylowane immunoprecypitację DNA (hmedip), a następnie sekwencjonowanie nowej generacji (hMeDIP-seq)., Szczury, odpowiednio, z grup kontrolnych (n = 3), HI (N = 3) i Tuina (N = 3) zostały uśmiercone na P31, a genomiczne DNA lewej kory skroniowej zostało ekstrahowane dla hMeDIP-seq. Genom-szeroki wzorzec 5 HMC poziom oceniał licząc 5 HMC-mapped czyta w każdym 10 kb bin od próbki kontrola, Tuina, i HI grupy i następnie znormalizowany do całkowitego uporządkowywać pokrycie. Jak pokazano na rysunkach 4(a)-4(c), rozmieszczenie genomu 5 HMC w trzech grupach było różne, a następnie dalej badaliśmy specyficzne regiony genów, w których te różnice istnieją., Rysunek 4 (d) pokazuje nakładające się cechy znormalizowanej gęstości 5 odczytów HMC ze znanymi cechami genomu NA zdefiniowanych ciałach genów i wyspach CGI (CPG) zgodnie z tabelą UCSC dla RGSC6.0 / rn6. Ponadto, jak pokazano na rysunku 4(e), badano również dystrybucję 5 hmC w organach genów i 1 kb w górę i w dół organów genów., Na podstawie rysunków 4 (d) i 4(e) można zaobserwować, że poziom 5 hmC grupy HI różnił się od poziomu grupy kontrolnej i grupy Tuina na końcu 5′ ciała genomowego, zwłaszcza w miejscach ±500 bp w transcriptional start sites (TSS) i CGI w obrębie 500 bp TSS.
3.2. Identyfikacja i adnotacja Differentially Hydroxymethylated Regions (DhMRs)
aby wskazać specyficzne loci wykazujące zmienione Profile 5 hmC, przystąpiliśmy do identyfikacji i scharakteryzowania specyficznych Dhmr wszystkich autosomów i chromosomów płciowych w całym genomie., Co ciekawe, była duża różnica w rozmieszczeniu hiper-Dhmr i hipo-Dhmr na chromosomie X (rysunki 5 (a) -5 (c)). W celu dalszego zbadania biologicznego znaczenia znalezionych Dhmr, geny związane z tymi Dhmr zostały wyodrębnione do analizy wzbogacenia ontologii genów (GO)., Jak pokazano na rysunkach 5 (d) i 5(e), analiza wzbogacenia GO wskazała, że te hipo-Dhmr w grupie HI stwierdzono wysoce wzbogacone na funkcjonalnych szlakach związanych z neurorozwojem i funkcjami neuronalnymi, w tym wzrost komórek rozwojowych, przedłużenie projekcji neuronów, pozytywna Regulacja wzrostu rozwojowego, wzrost rozwojowy zaangażowany w morfogenezę i różnicowanie komórek glejowych.,
na podstawie kompleksowej analizy list genów różnicowych hydroksymetylacji trzech grup, wybraliśmy sześć genów związanych z hipo-DhMRs z grupy HI, które były związane z funkcjami układu nerwowego, aby zbadać związek między zmianami 5 HMC i poziomami transkrypcji tych genów., Zgodnie z oczekiwaniami, stwierdzono, że zgodnie ze zmniejszoną modyfikacją 5 hmC w Casd1, Prkg2 i Slc44a1, odpowiednie poziomy mRNA zostały również znacznie zmniejszone w grupie HI w porównaniu z grupami kontrolnymi i Tuina (Rysunek 5(f)).
4. Dyskusja
dzięki ogólnemu bezpieczeństwu i renomowanej skuteczności, tradycyjna medycyna chińska (TCM) jest łatwo akceptowana przez ogólną populację na całym świecie. TCM jest szeroko stosowany w różnych chorobach pediatrycznych, takich jak mięsak Ewinga, astma, choroba Gravesa-Basedowa i dziecięce zaburzenia alergiczne ., Tymczasem istnieją również badania wskazujące, że terapie TCM, w tym Tuina, leki ziołowe i akupunktura są dobrze tolerowane i mają pozytywny wpływ terapeutyczny na Mózgowe Porażenie Dziecięce . Ze względu na obiecujące wyniki kliniczne i mniej skutków ubocznych, chiński masaż Tuina przyciąga rosnące zainteresowanie pod względem leczenia CP.
jako nowa modyfikacja epigenetyczna, 5 hmC służy nie tylko jako półprodukt procesów demetylacji DNA, ale także działa jako stabilny marker epigenetyczny podczas rozwoju różnych chorób ., 5 hmC jest około dziesięciokrotnie bardziej wzbogacony w neurony niż w innych komórkach, a jego dynamiczna regulacja ma kluczowe znaczenie w rozwoju neurodoperacji poporodowej . Ponadto uważa się, że zmiana globalnego poziomu 5 hmC jest ściśle związana z wieloma zaburzeniami neurodegeneracyjnymi i chorobami neurorozwojowymi .
jednak, zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, niewiele badań skupiło się na związku między hydroksymetylacją DNA a porażeniem mózgowym, co stało się inspiracją dla naszych badań., W naszym badaniu wyniki plamienia kropkowego i immunofluorescencji wykazały, że globalny poziom 5 hmC w Korie płata skroniowego mózgu został znacznie zmniejszony po urazie HI, co jest zgodne ze zmniejszonym poziomem 5 hmC w nerce myszy po reperfuzji niedokrwiennej . Jednak po leczeniu produktem Tuina poziom 5 hmC w grupie Tuina był wyższy niż w grupie HI., Ponadto wiadomo, że 5 HMC jest wytwarzane przez utlenianie 5 mC przez białka Tet, na podstawie których wykryliśmy poziomy białek Tet1 i Tet2 i stwierdziliśmy, że oba poziomy zostały znacznie zmniejszone po urazie HI, podczas gdy tylko białko Tet2 zostało zwiększone po leczeniu Tuina. W sumie wyniki te sugerują, że zmniejszona ekspresja Tet1 i Tet2 może przyczynić się do zmniejszenia 5 hmC po urazie HI, A Tuina może zwiększyć poziom 5 HMC poprzez zwiększenie ekspresji Tet2.,
przeciwnie, metylacja CGI w promotorach okazała się krytyczna w wyciszaniu genów, a 5 hmC może odgrywać rolę w ekspresji genów za pośrednictwem demetylacji DNA . W naszym badaniu grupa HI wykazała zmniejszenie wzbogacenia genomu 5 HMC w CGI w granicach 500 bp TSS w porównaniu do grupy kontrolnej i Tuina, podczas gdy Tuina zwiększyła dystrybucję genomu 5 hmC., Tymczasem, zgodnie z wcześniejszymi ustaleniami, że wzbogacenie 5 hmC w organizmie genu może mieć silną korelację ze zwiększoną transkrypcją danych genów w neuronach, nasze wyniki RT-PCR wykazały, że wyczerpaniu 5 modyfikacji HMC w genie Prkg2, Casd1 i Slc44a1 towarzyszył obniżony poziom mRNA tych genów w grupie HI., W oparciu o wszystkie powyższe ustalenia wskazano, że modyfikacja 5 hmC może odgrywać kluczową rolę w patogenezie CP poprzez regulację transkrypcji i ekspresji genów związanych z funkcjami neuronalnymi, A Tuina może wywoływać działanie terapeutyczne na CP poprzez modulowanie 5 hmC.
Co ciekawe, stwierdzono , że CP i związane z nimi zaburzenia rozwojowe są częściej obserwowane u mężczyzn i kobiet noworodków mysi model uszkodzenia mózgu Hi również wykazywał niższe występowanie CP specyficzne dla płci, którego przyczyna jest wciąż niepewna., Aby uniknąć zakłóceń wynikających z tego możliwego wpływu ochronnego na płeć, do naszego badania wybrano tylko samce szczura. 5 (a)), duże różnice w rozmieszczeniu hiper-Dhmr i hipo-Dhmr na chromosomie X zaobserwowano z porównania pomiędzy dowolnymi dwiema grupami w naszym badaniu, co dodatkowo potwierdza korelację między płcią a występowaniem mózgowego porażenia dziecięcego., W szczególności, ze względu na ograniczenia naszego laboratorium, nie mogliśmy wykonać kontroli IgG ani wygenerować bibliotek wejściowych, a Dhmr zostały zidentyfikowane poprzez bezpośrednie porównanie jednego z drugim, a nie porównywanie z danymi wejściowymi, które zamierzamy poprawić w naszych przyszłych badaniach, aby badania były bardziej precyzyjne.
ponadto analiza genów związanych z hipo-DhMRs w grupie HI wykazała, że geny te są wysoce wzbogacone w wiele szlaków sygnałowych związanych z neurodevelopment i funkcjami neuronalnymi., W naszym eksperymencie opóźnienie wzrostu i zaburzenia neurorozwojowe pojawiły się w grupie HI w postaci utraty wagi, osłabienia siły kończyn i kilku zaburzeń odruchu neuronalnego, które zostały w pewnym stopniu poprawione przez leczenie Tuina. Ponadto, na podstawie wyników testu labiryntu wodnego Morrisa i testu unikania stopniowego, Tuina znacznie poprawiła funkcje uczenia się i pamięci u szczurów niedotlenczo-niedokrwiennych., Wyniki te wskazują na korelację między zmianami w loci 5-hydroksymetylocytozyny a rozwojem neuronów i dalej sugerują, że terapia Tuina może wpływać na rozwój mózgu i mózgowe funkcje poznawcze poprzez modulowanie hydroksymetylacji DNA.
w niniejszym badaniu dostarczyliśmy na całym genomie 5 map HMC grup kontrolnych, HI i Tuina i ujawniliśmy zmiany w stanie hydroksymetylacji DNA i 5 zmian dynamicznych HMC po leczeniu Tuina, które mogą rzucić światło na możliwy mechanizm terapeutyczny Tuina dla CP.,
dostępność danych
dane wykorzystane na poparcie wyników tego badania są dostępne od autora korespondenta na żądanie.
konflikty interesów
autorzy oświadczają, że nie ma konfliktów interesów.
wkład autorów
yunpeng Zhang i Chao Gao przyczynili się w równym stopniu do tej pracy.,
podziękowania
ta praca była wspierana przez National Natural Science Foundation Of China (81774444), projekt badawczy Nauki i Technologii w prowincji Henan (182102310403), projekt badań klinicznych w Chinach i Kanadzie, program studiów za granicą prowincji Henan (201721) oraz projekt badawczy Nauki i Technologii Medycznych prowincji Henan (projekt budowlany prowincji i Ministerstwa) (201701034).