Být schopen rozlišovat bakteriálních druhů je důležité pro řadu důvodů, od diagnostikování infekce nebo kontrolu bezpečnosti potravin, určit, který druh to je, že dává sýr je to fantastický charakter. Bakteriální druhy, a dokonce i konkrétní kmeny mohou být rozlišeny pomocí řady molekulárních technik, jako je PCR, kvantitativní PCR, sekvenování genomu a hmotnostní spektrometrie., Ale i bez toho, aby se dostal do molekulární nitty kostrbaté, existují fenotypové rozdíly mezi skupinami bakterií, které je lze použít k jejich odlišení. To zahrnuje vlastnosti, jako je jejich tvar (bacily vs koky například), růst zejména živiny a preference pro vysoké nebo nízké kyslíku v prostředí. V závislosti na studované charakteristice mohou být bakteriální druhy rozděleny do širokých skupin, ale tyto informace mohou značně zúžit možnou identitu., Jedna taková užitečná klasifikace – pokud je bakterie grampozitivní nebo gramnegativní-je založena na struktuře bakteriálních buněčných stěn.
rozdíl ve struktuře gram pozitivních vs Gram negativních bakterií
níže uvedený diagram ilustruje rozdíly ve struktuře gram pozitivních a gramnegativních bakterií. Dvě klíčové vlastnosti, které vedou k rozdílné vizualizační vlastnosti Gram-pozitivní a Gram-negativní druhy jsou tloušťka peptidoglykanové vrstvy a přítomnost nebo nepřítomnost vnější lipidové membrány., Je to proto, že struktura stěny ovlivňuje schopnost buňky udržet krystalovou fialovou skvrnu použitou při barvení gram, která může být poté vizualizována pod světelným mikroskopem.
Gram-pozitivní bakterie mají tlustou vrstvou peptidoglykanu a ne vnější lipidové membrány, zatímco Gram-negativní bakterie mají tenkou vrstvou peptidoglykanu a vnější lipidové membrány.
protože grampozitivní bakterie postrádají vnější lipidovou membránu, když se správně odvolávají na jejich strukturu spíše než na barvicí vlastnosti, nazývají se monoderms., Vnější lipidová membrána vlastněná gramnegativními bakteriemi znamená, že pokud se odkazuje na jejich fyzickou strukturu, nazývají se didermy.
technika barvení Gram byla vyvinuta v roce 1884 dánským bakteriologem Hansem Christianem Gram1. Zatímco Gram stain vám neřeknu konkrétní druhy se díváte, to může být rychlý způsob, jak zúžit výrazně seznamu potenciálních kandidátů a přímý následné testování v případě potřeby.,
Gram-pozitivní vs Gram negativní skvrna
Gramovo barvení postup – Příprava vzorku
1. Označte snímek mikroskopu s čistým sklem pomocí identifikace vzorku. Ujistěte se, že používáte tužku, protože mnoho inkoustů je odstraněno činidly používanými při barvení.
2. Pokud připravujete snímek z kapalné bakteriální kultury:
Dab malou kapkovou kulturu na sklíčko pomocí sterilní smyčky. Jemně rozetřete kapku kruhovým pohybem do oblasti o průměru přibližně 1 cm., U velmi hustých kultur může být nutné předem zředit vaši kulturu, aby se zajistilo, že jednotlivé bakteriální buňky budou vidět pod mikroskopem po barvení.
Pokud zdrojový materiál je z bakteriální deska:
Resuspendujte smyčky kolonie materiál ve sterilní roztok chloridu sodného pufrovaný fosfátem (PBS) a pak postupovat jako při tekuté kultury.
3. Jakmile je nátěr vysušen na vzduchu, dvakrát nebo třikrát protáhněte rozmazaný snímek plamenem.
to zabíjí mikroby v nátěru a fixuje vzorek na snímek, dávejte pozor, abyste vzorek nepřehřívali, protože to může narušit buněčnou morfologii.,
gram stain procedure-Gram barvení vzorku
1. Jemně zaplavte skvrnu krystalovou fialkou a nechte 1 minutu. Skluz lehce nakloňte a jemně opláchněte vodou z vodovodu nebo destilovanou vodou.
Crystal violet je ve vodě rozpustné barvivo, které vstupuje do peptidoglykanové vrstvy v bakteriální buněčné stěně.
2. Jemně zaplavte nátěr gram jódem a nechte 1 minutu. Skluz lehce nakloňte a jemně opláchněte vodou z vodovodu nebo destilovanou vodou. Skvrna se nyní objeví fialová.,
gram roztok jódu (jod a jodid draselný) se přidá k vytvoření komplexu s krystalovou fialkou, která je mnohem větší a je nerozpustná ve vodě.
3. Dekolorujte nátěr pomocí 95% ethylalkoholu nebo acetonu. Mírně nakloňte snímek a aplikujte pokles alkoholu po kapkách, dokud alkohol nebude téměř čistý (5-10 sekund). Okamžitě opláchněte vodou, aby nedošlo k nadměrnému odbarvení.
Dekolorizátor dehydratuje peptidoglykanovou vrstvu, zmenšuje a utahuje ji., V grampozitivních bakteriích pak velké krystalové komplexy fialově-jodu nejsou schopny proniknout a uniknout tlusté peptidoglykanové vrstvě, což vede k fialovým barveným buňkám. U gramnegativních bakterií je však vnější membrána degradována, tenká peptidoglykanová vrstva není schopna udržet krystalově fialové-jodové komplexy a barva je ztracena.
4. Jemně zaplavte safraninovým protibolestem a nechte 45 sekund. Skluz lehce nakloňte a jemně opláchněte vodou z vodovodu nebo destilovanou vodou.,
Safranin je slabě rozpustná ve vodě a skvrnu bakteriální buňky světle červené, umožňující vizualizaci Gram negativních buňkách, aniž by zasahoval s pozorováním fialové Gram pozitivní buňky.
5. Osušte snímek na filtračním papíru a poté si prohlédněte nátěr pomocí světelného mikroskopu pod ponořením do oleje.
Gram-pozitivní vs Gram negativní barva
Gram-pozitivní bakterie
Gram-pozitivní bakterie mají výrazný fialový vzhled při pozorování pod světelným mikroskopem po Gram barvení., To je způsobeno zadržením fialové krystalové fialové skvrny v tlusté peptidoglykanové vrstvě buněčné stěny. Příklady Gram pozitivních bakterií zahrnují všechny stafylokoky, všechny streptokoky a některé druhy listeria.
Gram-negativní bakterie
Gram-negativní bakterie se objeví bledě načervenalou barvu, když pozorován pod světelným mikroskopem po Gram barvení. To je proto, že struktura jejich buněčná stěna je schopna udržet křišťálově fialové skvrny, takže jsou barevné pouze safranin counterstain., Příklady gramnegativních bakterií zahrnují enterokoky, druhy salmonel a druhy pseudomonas.
gram barvení nelze spolehlivě použít k posouzení bakteriálních fylogenetických vztahů. Jediná membrána grampozitivních druhů je považována za rodový stav. Historicky se předpokládalo, že druhá membrána nalezená na gramnegativních bakteriích se vyvinula jen jednou, a tak všechny gramnegativní druhy byly navzájem těsněji příbuzné než grampozitivní druhy., Nicméně, genetické analýzy, od té doby zobrazeno v tomto případě, a je pravděpodobné, že se vyvinuly několikrát v různých linií – produkt konvergentní evoluce.