at Være i stand til at differentiere bakterielle arter, der er vigtigt for en lang række årsager til, diagnosticere infektion eller kontrol af fødevaresikkerhed, til at identificere, hvilke arter det er, der giver en ost, det er fantastisk karakter. Bakteriearter og endda specifikke stammer kan differentieres ved hjælp af et antal molekylære teknikker, såsom PCR, kvantitativ PCR, genomsekvensering og massespektrometri., Men selv uden at komme ind i den molekylære nitty gritty, er der fænotypiske forskelle mellem grupper af bakterier, der kan bruges til at differentiere dem. Dette inkluderer egenskaber som deres form (baciller vs cocci for eksempel), vækst især næringsstoffer og præference for miljøer med højt eller lavt ilt. Afhængigt af det kendetegn, der studeres, kan bakteriearter opdeles i brede grupper, men samlet set kan disse oplysninger indsnævre de mulige identiteter meget., En sådan nyttig klassificering – hvis en bakterie er grampositiv eller gramnegativ – er baseret på strukturen af bakteriecellevægge.
forskel i struktur af grampositive vs gramnegative bakterier
diagrammet nedenfor illustrerer forskellene i strukturen af grampositive og gramnegative bakterier. De to nøglefunktioner, der fører til de forskellige visualiseringsegenskaber af Gram-positive og Gram-negative arter, er tykkelsen af peptidoglycan-laget og tilstedeværelsen eller fraværet af den ydre lipidmembran., Dette skyldes, at vægstrukturen påvirker cellens evne til at bevare den krystalviolette plet, der anvendes i Gram-farvningsproceduren, som derefter kan visualiseres under et lysmikroskop.
Gram positive bakterier har en tyk peptidoglycan lag og ingen ydre lipid membran, mens de Gram negative bakterier har en tynd peptidoglycan lag og har en ydre lipid membran.
Da grampositive bakterier mangler en ydre lipidmembran, når de korrekt henviser til deres struktur snarere end farvningsegenskaber, betegnes monodermer., Den ydre lipidmembran besat af gramnegative bakterier betyder, at når de henviser til deres fysiske struktur, kaldes de didermer.
Gram-farvningsteknikken blev udviklet i 1884 af den danske bakteriolog Hans Christian Gram1. Mens en Gram-plet ikke fortæller dig de specifikke arter, du ser på, kan det være en hurtig måde at indsnævre listen over potentielle kandidater og direkte opfølgningstest, hvor det er nødvendigt.,
Gram positive vs Gram negative pletten
Gram pletten procedure – at Forberede en prøve
1. Mærk et rent glasmikroskop med din prøveidentifikation. Sørg for at bruge en blyant, da mange blæk fjernes af de reagenser, der bruges i farvningsproceduren.
2. Hvis du forbereder dit objektglas fra en flydende bakteriekultur:
skub en lille dråbekultur ned på objektglasset ved hjælp af en steril løkke. Smør forsigtigt dråben i en cirkulær bevægelse ind i et område på cirka 1 cm i diameter., For meget tætte kulturer kan det være nødvendigt at fortynde din kultur for at sikre, at individuelle bakterieceller kan ses under et mikroskop efter farvning.
Hvis kildematerialet er fra en bakterieplade:
Resuspender en løkke kolonimateriale i sterilt fosfatbufret saltvand (PBS) og fortsæt derefter som for en flydende kultur.
3. Når smøret er lufttørret, skal du føre det smurte dias gennem en flamme to eller tre gange.
dette dræber mikroberne i smøret og fikserer prøven til diaset, pas på ikke at overophede prøven, da dette kan forvrænge cellulær morfologi.,
Gram farvning procedure – Gram farvning en prøve
1. Fyld forsigtigt smøret med krystalviolet og lad det stå i 1 minut. VIP objektglasset let og Skyl forsigtigt med ledningsvand eller destilleret vand.
Crystal violet er et vandopløseligt farvestof, der kommer ind i peptidoglycan-laget i bakteriecellevæggen.
2. Fyld forsigtigt smøret med Grams jod og lad det stå i 1 minut. VIP objektglasset let og Skyl forsigtigt med ledningsvand eller destilleret vand. Udstrygningen vises nu lilla.,
Grams iodopløsning (jod og kaliumiodid) tilsættes for at danne et kompleks med krystalviolet, som er meget større og er uopløseligt i vand.
3. Affarv smøret ved hjælp af 95 % ethylalkohol eller acetone. VIP objektglasset lidt, og påfør alkoholen dråbe for dråbe, indtil alkoholen løber næsten klar (5-10 sekunder). Skyl straks med vand for at undgå overfarvning.decolori .er dehydrerer peptidoglycan-laget, krymper og strammer det., I grampositive bakterier er de store krystalviolette-jodkomplekser derefter ikke i stand til at trænge ind og undslippe det tykke peptidoglycan-lag, hvilket resulterer i lilla farvede celler. I gramnegative bakterier nedbrydes imidlertid den ydre membran, det tynde peptidoglycan-lag er ikke i stand til at bevare krystalviolet-jodkomplekserne, og farven går tabt.
4. Forsigtigt oversvømme med safranin counterstain og lad i 45 sekunder. VIP objektglasset let og Skyl forsigtigt med ledningsvand eller destilleret vand.,
Safranin er svagt vandopløseligt og vil plette bakterieceller en lys rød, hvilket muliggør visualisering af Gram-negative celler uden at forstyrre observationen af lilla af de Gram-positive celler.
5. Blot objektglasset tørt på filterpapir, og se derefter udstrygningen ved hjælp af et lysmikroskop under nedsænkning af olie.
Gram positive vs Gram negative farve
Gram positive bakterier
Gram positive bakterier har en karakteristisk lilla udseende, når de observeres under et lysmikroskop følgende Gram farvning., Dette skyldes tilbageholdelse af den lilla krystalviolette plet i det tykke peptidoglycan-lag af cellevæggen. Eksempler på Gram-positive bakterier inkluderer alle stafylokokker, alle streptokokker og nogle listeria-arter.
Gram negative bakterier
Gram negative bakterier, vises en bleg rødlig farve, når de observeres under et lysmikroskop følgende Gram farvning. Dette skyldes, at strukturen af deres cellevæg ikke er i stand til at bevare den krystalviolette plet, så de kun er farvet af safranin-modskindet., Eksempler på gramnegative bakterier inkluderer enterokokker, salmonella-arter og pseudomonas-arter.
Gram farvning kan ikke anvendes pålideligt til at vurdere bakterielle fylogenetiske forhold. Den enkelte membran af Gram positive arter menes at være forfædres tilstand. Historisk set havde man troet, at den anden membran, der findes på gramnegative bakterier, udviklede sig kun .n gang, og derfor var alle gramnegative arter tættere beslægtede med hinanden end de var til grampositive arter., Imidlertid har genetisk analyse siden vist, at dette ikke er tilfældet, og det vil sandsynligvis have udviklet sig flere gange i forskellige linjer – et produkt af konvergent udvikling.