Essere in grado di distinguere le specie batteriche è importante per una serie di motivi, dalla diagnosi di infezioni o di controllo per la sicurezza alimentare, ad identificare di quale specie è che dà un formaggio è un personaggio fantastico. Specie batteriche, e anche ceppi specifici possono essere differenziati utilizzando una serie di tecniche molecolari come PCR, PCR quantitativa, sequenziamento del genoma e spettrometria di massa., Ma anche senza entrare nel nitty gritty molecolare, ci sono differenze fenotipiche tra gruppi di batteri che possono essere utilizzati per differenziarli. Ciò include caratteristiche come la loro forma (bacilli vs cocchi per esempio), la crescita in particolari nutrienti e la preferenza per ambienti ad alto o basso ossigeno. A seconda della caratteristica studiata, le specie batteriche possono essere suddivise in ampi gruppi, ma prese insieme queste informazioni possono restringere notevolmente le possibili identità., Una tale classificazione utile-se un batterio è Gram positivo o Gram negativo-si basa sulla struttura delle pareti cellulari batteriche.
Differenza nella struttura dei batteri Gram positivi vs Gram negativi
Lo schema seguente illustra le differenze nella struttura dei batteri Gram positivi e Gram negativi. Le due caratteristiche chiave che portano alle diverse proprietà di visualizzazione delle specie Gram positive e Gram negative sono lo spessore dello strato di peptidoglicano e la presenza o l’assenza della membrana lipidica esterna., Questo perché la struttura della parete influisce sulla capacità della cellula di trattenere la macchia viola cristallina utilizzata nella procedura di colorazione Gram che può quindi essere visualizzata al microscopio ottico.
I batteri gram positivi hanno uno spesso strato di peptidoglicano e nessuna membrana lipidica esterna, mentre i batteri Gram negativi hanno uno strato di peptidoglicano sottile e hanno una membrana lipidica esterna.
Poiché i batteri Gram positivi mancano di una membrana lipidica esterna, quando si riferiscono correttamente alla loro struttura piuttosto che alle proprietà di colorazione, vengono definiti monodermi., La membrana lipidica esterna posseduta da batteri Gram negativi significa che, quando si fa riferimento alla loro struttura fisica, sono chiamati didermi.
La tecnica di colorazione Gram è stata sviluppata nel 1884 dal batteriologo danese Hans Christian Gram1. Mentre una macchia di grammo non ti dirà le specie specifiche che stai guardando, può essere un modo rapido per restringere notevolmente l’elenco dei potenziali candidati e test di follow-up diretti dove necessario.,
Colorazione gram positiva vs Gram negativa
Procedura di colorazione gram – Preparazione di un campione
1. Etichettare un vetrino da microscopio pulito con l’identificazione del campione. Assicurarsi di utilizzare una matita come molti inchiostri vengono rimossi dai reagenti utilizzati nella procedura di colorazione.
2. Se si prepara il vetrino da una coltura batterica liquida:
Tamponare una piccola coltura goccia sul vetrino utilizzando un anello sterile. Spalmare delicatamente la goccia con un movimento circolare in un’area di circa 1 cm di diametro., Per colture molto dense potrebbe essere necessario pre-diluire la coltura per garantire che le singole cellule batteriche possano essere viste al microscopio dopo la colorazione.
Se il materiale di origine proviene da una piastra batterica:
Risospendere un ciclo di materiale di colonia in soluzione salina tampone fosfato sterile (PBS) e quindi procedere come per una coltura liquida.
3. Una volta che lo striscio si è asciugato all’aria, passare il vetrino spalmato attraverso una fiamma due o tre volte.
Questo uccide i microbi nello striscio e fissa il campione alla diapositiva, fare attenzione a non surriscaldare il campione tuttavia in quanto ciò può distorcere la morfologia cellulare.,
Procedura di colorazione gram – Colorazione gram di un campione
1. Inondare delicatamente lo striscio con viola di cristallo e lasciare agire per 1 minuto. Inclinare leggermente il vetrino e risciacquare delicatamente con acqua di rubinetto o acqua distillata.
Crystal violet è un colorante solubile in acqua che entra nello strato di peptidoglicano nella parete cellulare batterica.
2. Inondare delicatamente lo striscio con iodio di grammo e lasciare agire per 1 minuto. Inclinare leggermente il vetrino e risciacquare delicatamente con acqua di rubinetto o acqua distillata. La macchia ora apparirà viola.,
La soluzione di iodio di Gram (iodio e ioduro di potassio) viene aggiunta per formare un complesso con il cristallo viola, che è molto più grande ed è insolubile in acqua.
3. Decolorare lo striscio usando alcool etilico al 95% o acetone. Inclinare leggermente il vetrino e applicare l’alcool goccia a goccia fino a quando l’alcool è quasi limpido (5-10 secondi). Risciacquare immediatamente con acqua per evitare una decolorazione eccessiva.
Decolorizer disidrata lo strato di peptidoglicano, restringendolo e stringendolo., Nei batteri gram positivi, i grandi complessi di cristallo viola-iodio non sono quindi in grado di penetrare e sfuggire allo spesso strato di peptidoglicano, con conseguente cellule macchiate di viola. Tuttavia, nei batteri Gram negativi, la membrana esterna è degradata, il sottile strato di peptidoglicano non è in grado di trattenere i complessi di iodio-viola cristallino e il colore è perso.
4. Inondare delicatamente con safranin counterstain e lasciare agire per 45 secondi. Inclinare leggermente il vetrino e risciacquare delicatamente con acqua di rubinetto o acqua distillata.,
La safranina è debolmente solubile in acqua e macchia le cellule batteriche di un rosso chiaro, consentendo la visualizzazione delle cellule Gram negative senza interferire con l’osservazione del viola delle cellule Gram positive.
5. Asciugare il vetrino su carta da filtro, quindi visualizzare lo striscio con un microscopio ottico ad immersione in olio.
Colore gram positivo vs Gram negativo
Batteri gram positivi
I batteri gram positivi hanno un caratteristico aspetto viola se osservati al microscopio ottico dopo la colorazione di Gram., Ciò è dovuto alla ritenzione della macchia viola di cristallo viola nello spesso strato di peptidoglicano della parete cellulare. Esempi di batteri gram positivi includono tutti gli stafilococchi, tutti gli streptococchi e alcune specie di listeria.
Batteri gram negativi
I batteri gram negativi appaiono di un colore rossastro pallido se osservati al microscopio ottico dopo la colorazione di Gram. Questo perché la struttura della loro parete cellulare non è in grado di trattenere la macchia viola di cristallo, quindi sono colorati solo dal controstain safranin., Esempi di batteri gram negativi includono enterococchi, specie di salmonella e specie di pseudomonas.
La colorazione gram non può essere utilizzata in modo affidabile per valutare le relazioni filogenetiche batteriche. Si pensa che la singola membrana delle specie Gram positive sia lo stato ancestrale. Storicamente si era pensato che la seconda membrana trovata sui batteri Gram negativi si fosse evoluta solo una volta e quindi tutte le specie Gram negative erano più strettamente correlate l’una all’altra di quanto non fossero le specie Gram positive., Tuttavia, l’analisi genetica da allora ha dimostrato che questo non è il caso ed è probabile che si sia evoluto più volte in diversi lignaggi – un prodotto di evoluzione convergente.